[发明专利]一种大麦休眠基因MKK3的KASP功能分子标记及应用

说明书

本发明属于分子生物学领域，具体涉及鉴定大麦穗发芽相关的休眠基因MKK3等位变异的KASP分子标记及其应用。具体技术方案为：一种引物组合物KASP‑N260T，包括两条正向引物(AL1,AL2)，其序列分别如SEQIDNO.3、4所示；一条反向引物C，其序列如SEQIDNO.5所示。本发明提供了一种KASP功能分子标记，能对大麦MKK3等位基因进行准确分型，预测大麦种子的休眠性。利用本发明所提供的技术，可在实验室条件下大规模快速鉴定大麦群体中的MKK3休眠等位基因，进一步用于分子标记辅助选择育种，可显著提高大麦抗穗发芽新品种培育的效率和准确性。

技术领域

本发明属于大麦基因检测及作物遗传育种技术领域，具体涉及一种大麦休眠基因MKK3的KASP功能分子标记及其应用。

背景技术

穗发芽(Pre-harvest Sprouting，PHS)是指谷物在收获前遇到连绵阴雨，未及收获便在穗上发芽的一种现象。

穗发芽不仅会造成大面积粮食减产，而且会严重劣化谷物加工食品品质，并直接影响籽粒种用价值。穗发芽导致大麦产量和品质严重下降，尤其啤用大麦穗发芽的籽粒麦芽完全不可用。选育和推广抗性品种是防治大麦穗发芽的最有效途径。

穗发芽是受多个遗传因子控制和环境影响的复杂数量性状。其中，种子休眠性强弱与穗发芽性状密切相关，弱休眠品种易穗发芽，而强休眠品种表现较高的穗发芽抗性。已报道大麦中存在两个与种子休眠相关的主效QTL位点SD1和SD2，其中SD2主效QTL位点(Qsd2-AK)能解释品种间23％-37％的种子休眠和穗发芽抗性表型变异。大麦的丝裂原活化蛋白激酶3(Mitogen-activated protein kinase kinase 3,MKK3)作为Qsd2-AK位点的候选基因，是控制大麦品种休眠性和穗发芽抗性的关键基因。MKK3的第7个外显子存在两个功能性的单核苷酸多态性(SNP)变异：A³⁰⁴¹/C³⁰⁴¹，该位置的单碱基突变使得MKK3蛋白的第260个天冬酰胺(N)变为苏氨酸(T)，从而使MKK3蛋白激酶的活性降低，直接影响种子的休眠特性。通常携有A³⁰⁴¹(Allele A)的品种休眠性弱、易穗发芽，携有C³⁰⁴¹(Allele C)的品种则表现较强的种子休眠和穗发芽抗性。携有Allele A或Allele C的大麦MKK3等位基因分布与品种来源和长期的人工选择有关，在抗穗发芽大麦品种培育中具有很好的育种价值。

杂交结合表型选择的传统育种方法往往因为宏观上性状鉴定不准确而需要加大回交群体，这极大的增加了育种工作量与成本。采用与性状连锁的分子标记辅助选择，结合常规表型鉴定的分子育种，不但显著提高了目标性状选择的准确性，而且能大大降低工作量，减少育种的成本和周期。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。SNP数量多，分布广泛，已成为第三代遗传标记。大量研究证实，在农作物抗病、抗逆、产量和品质等重要性状基因中存在丰富的SNP，某些位于基因内含子或编码区的SNP突变导致基因功能的显著改变，从而产生明显的性状变异。因此，针对目标基因序列变异的功能分子标记开发在等位基因鉴定和分子标记辅助选择育种中具有更强的应用前景。

相比于CAPS标记，凝胶电泳等传统的SNP检测方法，基于竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR，KASP)技术的SNP基因分型方法具有明显的诸多优点。KASP标记可以通过通用荧光探针来无差别的连接目标引物，检测过程无需电泳，减少了实验操作过程对环境的污染和人体的伤害，具有准确性和通量化程度高、针对性强、操作简单、平台兼容性好、实验操作安全和数据自动化采集准确等优势。目前，KASP已成为国际上SNP鉴定的主流方法之一，在遗传研究的基因分型和分子标记辅助育种中发挥重要作用。