[发明专利]抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体的制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体的制备方法和应用。所述杂交瘤细胞株2B2D7于2020年8月20日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2020134。本发明能够特异性分选到罗非鱼的CD3ε⁺T淋巴细胞群，为罗非鱼适应性免疫机制研究提供重要的免疫学工具。

技术领域

本发明属于鱼类免疫学领域，具体涉及一种分泌抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B2D7、单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

T淋巴细胞作为适应性免疫应答的主要执行者，发挥细胞免疫及免疫调节等功能，并对体内细菌、病毒等多种病原微生物的感染进行清除。T细胞表面糖蛋白CD3是一种成熟T细胞标志性的分化抗原，在T细胞的发育、激活及执行免疫功能等方面发挥着重要作用。CD3主要有γ、δ、ε、ζ和η链五条链，其中CD3ε链主要接受抗原刺激信号以及介导免疫信号的传递。CD3ε包含1个Ig样(免疫球蛋白样)结构域和1个ITAM结构域，能够与CD3γ、CD3δ和CD3ζ以及T细胞受体α/β和γ/δ异二聚体一起形成TCR-CD3复合物。TCR-CD3复合物的CD3亚单位包含两个确定的信号域，富含脯氨酸的序列和免疫酪氨酸活化基序(ITAMs)。在接受抗原刺激后，作为TCR的共受体，CD3ε复合物的ITAMs中的酪氨酸残基被下游LCK磷酸化，并募集ZAP70结合到CD3ε上后，T细胞活化衔接因子LAT被磷酸化，招募多个衔接因子和效应分子(如SLP76、PLCγ1等)，形成LAT信号传导复合物，从而介导下游信号通路的激活，包括mTOR、CaM、MAPK和NF-κB信号通路等。

在硬骨鱼中，早已克隆到CD3ε分子。硬骨鱼CD3ε同样包含着一个Ig结构域和ITAM活化基序，这提示我们硬骨鱼CD3ε作为T细胞的特异性分子标志的潜在可能以及在适应性免疫应答中的决定地位。然而，缺乏针对硬骨鱼类的抗体工具使得对硬骨鱼T细胞免疫机制的研究进展缓慢。由于跨膜蛋白的复杂性，目前仍然难以表达出大量保留完整天然结构和原有功能的蛋白，这使得传统单克隆抗体制备方法难以应用到T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体的制备过程中。

近年来，罗非鱼(包括尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus)作为重要的淡水养殖经济鱼类，在中国乃至全球水产养殖业中的重要性日益显著，然而随着养殖规模的不断扩大，疾病所造成的危害也越来越突出，严重影响我国罗非鱼养殖产业的发展。对于罗非鱼免疫机制的研究迫在眉睫。因此，制备尼罗罗非鱼CD3ε单克隆抗体，探究T细胞介导的适应性免疫应答机制，对于鱼病防治，疫苗开发以及填补硬骨鱼适应性免疫进化研究具有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明针对上述现有技术中的缺陷，提供了一株能够稳定分泌抗罗非鱼CD3ε单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B2D7、单克隆抗体及其制备方法和应用，使其能够特异性识别到罗非鱼的T淋巴细胞群，为硬骨鱼的适应性免疫机制研究提供重要的免疫学工具。

本发明为解决上述技术问题所提供的技术方案如下：

一方面，提供了一株分泌抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B2D7，且所述杂交瘤细胞株2B2D7于2020年8月20日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2020134。

还提供了一种上述杂交瘤细胞株2B2D7的制备方法，其括如下步骤：

采用包含有罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε基因的逆转录病毒对细胞进行感染；

将感染后的细胞作为抗原进行动物免疫；

动物免疫后进行细胞融合、细胞筛选和克隆，以获得所述杂交瘤细胞株2B2D7。

优选的，包含有罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε基因的逆转录病毒的制备过程包括：采用包含有罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε基因的质粒对细胞进行转染，以获得含有逆转录病毒的上清。