[发明专利]一种急性肺损伤肠道菌群多样性的分析方法

权利要求书

1.一种急性肺损伤肠道菌群多样性的分析方法，包括以下步骤：

S1、收集样本：将急性肺损伤病人的粪便排泄至干净的容器中，以及用棉签粘取少量放置入含有无菌生理盐水的试管内部，盖上盖子密封，将试管放置入医用冷柜内，冷藏24小时，使得菌群稳定，不发生改变；

S2、样本DNA抽提：将步骤S1、收集样本中的试管送达至样本提取处，提取DNA模板；

S3、PCR扩增：提取步骤S2、样本DNA抽提中细菌基因组DNA模板，PCR产物包含待测区域、测序引物、特异性引物、区分样本的Barcode和测序仪，利用特异性引物扩增16srDNA的V4区域，样本扩增后，采用琼脂糖凝胶电泳检测产物的纯度和特异性，应在相应片段大小位置出现一条清晰且明显的主条带，在其它位置不应有任何明显杂带，并进行精确定量和纯化回收，根据仪器的使用说明，进行标本的测序，产出数据。

S4、数据信息分析：

S401、有效序列统计；

S402、有效序列长度分布统计；

S403、OUT聚类及物种信息标注；

S404、多样性指数；

S405、宏基因组测序分析。

2.根据权利要求1所述的一种急性肺损伤肠道菌群多样性的分析方法，其特征在于：所述步骤S1、收集样本中，无菌生理盐水为80-100ml。

3.根据权利要求1所述的一种急性肺损伤肠道菌群多样性的分析方法，其特征在于：所述步骤S2、样本DNA抽提中，挑取单菌落到5-10mL盛有LB和MRS液体培养基的PA瓶中，在30℃条件下，活化3-4h，若培养液稍浑浊，则取1-2mL加入灭菌离心管中，以及12000r/min条件下离心1-3min，除去上清液，再加入1-2mLSTE悬浮菌体，重复上述步骤，12000r/min离心1-3min，除去上清液，以及向收集的菌体中加人100-240μLTE，沸水煮5-15min，立即冰浴5-15min，离心2-7min取上清液即为DNA模板，将基因组DNA放于-20℃，保存备用。

4.根据权利要求1所述的一种急性肺损伤肠道菌群多样性的分析方法，其特征在于，所述步骤S3、PCR扩增中，扩增子序列16rDNA分析流程:第一步，原始扩增子测序数据；第二步，数据质控和筛选；第三步，扩增子数据库对比；第四步，分别OUT分类、物种分布和系统发生树构建；第五步，将步骤第四步中OUT分类和物种分布进行生物种类和丰度估计；第六步，提取多样本，将样本间群落结构对比；第七步，微生物生物分布与环境关联分析。

5.根据权利要求1所述的一种急性肺损伤肠道菌群多样性的分析方法，其特征在于：所述步骤S404、多样性指数中，测得所有细菌种类、数量和比例，用于确定该样本人体菌群健康等级情况；将获得数据与标准数据库比对，确定该样本与健康人群、疾病人群的相似性，最终评估该样本受检者的健康情况，并进行后处理预估或者就医处理。

6.根据权利要求1所述的一种急性肺损伤肠道菌群多样性的分析方法，其特征在于：所述步骤S405、宏基因组测序分析中，通过宏基因组测序的方法，将肠道微生物与疾病进行关联分析以揭示疾病与健康个体间的微生物差异；鉴定特定环境中的特定微生物发现耐受菌种及相关基因；可以研究物种的分类，研究与特定环境相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物群落内部、微生物与环境、微生物与宿主之间的关系。