[发明专利]一种热稳定性和高酶活力的重组褐藻胶裂解酶及其应用

说明书

本发明是提供一种具有更好热稳定性和高酶活力的褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO5；本发明所提供的突变酶用于制备褐藻胶寡糖。本发明利用基因改造的重组褐藻胶裂解酶，定向制备褐藻胶寡糖，与现有酸法水解制备褐藻胶寡糖的方法相比，克服了破坏性大的缺点，与现有的酶法水解制备褐藻胶寡糖的方法相比，运用改造的重组褐藻胶裂解酶，可减少加酶量、缩短酶解时间、提高酶解效率。本发明的酶具有高酶活力和高热稳定性，更适合应用于工业上酶解褐藻胶制备褐藻胶寡糖。所制备的褐藻胶寡糖有抗肿瘤、抗炎、降血脂和提高免疫力等功效，可用于食品及保健品领域，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于褐藻胶酶技术领域，具体涉及一种具有更好热稳定性和高酶活力的褐藻胶裂解酶。

背景技术

褐藻胶寡糖(alginate oligosaccharides)是褐藻胶经水解而得到的聚合度小且水溶性好的低分子量片段。由于褐藻胶寡糖具有降血脂、抗病毒、抗肿瘤以及抗氧化等多种生理活性，可广泛应用在食品、医药及化妆品等领域，具有巨大的应用和开发价值。最新研究表明：用褐藻胶制备的聚M段寡糖药物“971”能抑制β淀粉样细胞的聚集和细胞毒性，正用于抗阿尔兹海默症的二期临床研究；聚G寡糖可与抗生素协同抑制临床多耐药致病菌。因此，组成特殊、聚合度特定的褐藻胶寡糖具有重要应用价值和经济价值，实现这类寡糖的高效制备具有重要意义。

褐藻胶寡糖的制备方法主要有酸法水解和酶法水解。酸法水解会不同程度破坏褐藻胶寡糖的结构，而酶法水解具有反应条件温和等优点，因此，酶法水解制备褐藻胶寡糖受到广泛关注。海洋微生物是褐藻胶裂解酶的重要来源，一些褐藻胶裂解酶相继从弧菌、交替单胞菌、假交替单胞菌中分离出来。但由于海洋环境的特殊性，导致海洋微生物产生的褐藻胶裂解酶产量低、酶活力不能满足制备褐藻胶寡糖的需求。目前，已有很多褐藻胶裂解酶被克隆表达，其表达量、酶活力较原始酶均有所提升，但其酶学性质，如热稳定性、酶活力仍需进一步提升。在工业制备褐藻胶寡糖时，提高酶的热稳定性可以减少酶的用量，提高酶解效率，增加寡糖得率。因此，寻找酶学性质优且可高效降解褐藻胶的褐藻胶裂解酶仍是研究者关注的重点。

发明内容

本发明的目的是提供一种热稳定性和高酶活力的褐藻胶裂解酶，以及应用该酶来制备褐藻胶寡糖的方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明所提供的褐藻胶裂解酶D59C-A267C，其氨基酸序列为MKVSCAVVLSACIASANADNNGDGKADSIKENDLNAGYADGTYFYTAADGGMVFRCPICGYKTSTNTSYTRTELREMLRRGDTSIATQGVNGNNWVFGSAPASAREAAGGVDGVLRATLAVNHVTTTGDSGQVGRVIVGQIHANNDEPLRLYYRKLPGHSKGSVYIAHEPNGGSDSWYDMIGSRSSSASDPSDGIALDEVWSYEVKVVGNTLTVTIFRAGKDDVVQVVDMGNSGYDVADQYQYFKAGVYNQNNTGNASDYVQVTFYCLEQSHD(SEQ ID NO:3)；

编码基因序列如下：