[发明专利]一种油炸薯片中羧甲基赖氨酸含量的检测方法

权利要求书

1.一种油炸薯片中羧甲基赖氨酸(N^ε-carboxymethyllysine，CML)含量的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）称取样品并对其进行脱脂处理；

（2）用磷酸盐缓冲溶液配制酸性蛋白酶溶液；

（3）向装有脱脂后样品的离心管中加入酸性蛋白酶溶液，然后加入同位素内标，最后将离心管密封后涡旋混匀，使样品水解；

（4）样品水解完成后进行离心收集上清液，然后用甲酸溶液浸提样品中的残留物并离心收集上清液；将样品水解后的上清液和甲酸溶液浸提后的上清液混合过滤得预处理样品液；

（5）采用MCX固相萃取柱对预处理样品液进行固相萃取净化得到洗脱液，然后将洗脱液吹干、复溶和过滤得到待测溶液；

（6）采用超高效液相色谱-串联质谱法(Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS)对待测溶液进行检测，通过内标法曲线计算CML的含量。

2. 根据权利要求1所述的一种油炸薯片中CML含量的检测方法，其特征在于：所述步骤（1）脱脂步骤为：将油炸薯片样品研磨至粒径为0.4-0.5 mm，向样品中加入正己烷涡旋混匀并离心，离心速度为3500-4500 r/min，时间为2-4 min，弃去正己烷，上述正己烷脱脂过程共执行3次，最后将样品于35℃-40℃下用氮气吹干以挥发除去正己烷。

3. 根据权利要求1所述的一种油炸薯片中CML含量的检测方法，其特征在于：所述步骤（2）磷酸盐缓冲溶液由0.15-0.25 mol/L的H₃PO₄溶液和浓度为0.15-0.25 mol/L的NaH₂PO₄溶液配制而成，该磷酸盐缓冲溶液的pH值为2-4。

4. 根据权利要求3所述的一种油炸薯片中CML含量的检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中酸性蛋白酶的酶活力为45000-55000 U/g，其在溶液中浓度为0.035-0.045 g/mL。

5. 根据权利要求1所述的一种油炸薯片中CML含量的检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中向装有脱脂后样品的离心管中加入酸性蛋白酶溶液后，样品中酸性蛋白酶的含量为4500-5500 U/g；CML的同位素内标物为氘代羧甲基赖氨酸（N^ε-carboxymethyllysine-D₄，CML-D₄），其浓度为4.0-6.0 μg/mL。

6. 根据权利要求5所述的一种油炸薯片中CML含量的检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中离心管密封后涡旋混和均匀，于35℃-40℃水浴中水解10-14 h，每25-35 min涡旋混匀1次，使之水解均匀。

7. 根据权利要求1所述的一种油炸薯片中CML含量的检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中离心转速为3500-4500 r/min，离心时间为3-5 min。

8. 根据权利要求7所述的一种油炸薯片中CML含量的检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中甲酸溶液的体积浓度为4%-6.0%，甲酸溶液浸提样品中的残留物后在3500-4500 r/min离心3-5 min，重复至少3次。

9.根据权利要求1所述的一种油炸薯片中CML含量的检测方法，其特征在于：所述步骤（5）净化方法为：对MCX固相萃取柱进行预处理后，将步骤（4）得到的预处理样品进行上样，然后用体积浓度为4%-6.0%甲酸水溶液淋洗，真空抽干；再用甲醇淋洗，真空抽干；弃去全部流出液；最后用体积浓度为12%-18%氨水甲醇溶液洗脱，真空抽干；收集洗脱液，洗脱液于35℃-40℃下用氮气吹干，超纯水复溶，得到净化后的待测液。

10. 根据权利要求1所述的油炸薯片中CML含量的检测方法，其特征在于：所述步骤（6）中的液相色谱条件为，仪器：ACQUITY超高效液相色谱仪；色谱柱：ACQUITY BEH AmideHILIC柱(2.1×100 mm，1.7 µm)；保护柱：ACQUITY BEH Amide Vanguard柱(1.7 µm)；柱温：35℃；进样量：5 μL；运行时间：7.0 min；流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为乙腈；以0.30mL/min进行梯度洗脱，洗脱参数如下：0-2.0 min 10% A, 2.0-6.0 min 20% A, 6.0-6.1min 90% A, and 6.1-7.0 min 10% A；

质谱条件为，仪器：XEVO TQ三重四级杆串联质谱仪；离子源模式：ESI⁺；监测模式：MRM；毛细管电压：2.0 kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流速：650 L/h；锥孔气流速：50 L/h；脱溶剂气和锥孔气体为氮气；碰撞气体为氩气，CML和CML-D₄的质谱参数如下：CML m/z 205.22-m/z 84.00定性，m/z 205.22-m/z 130.00定量；CML-D₄ m/z 209.00-m/z 87.70定性。