[发明专利]基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法

说明书

本发明公开了基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法，特点是包括将DNA Walker摆臂链溶液和含待测食源性致病菌适配体的保护探针溶液等体积混合后反应后缓慢降至室温，形成受保护的DNA Walker链溶液的步骤；将氨基化四氧化三铁和戊二醛混合，在室温下搅拌，磁清洗后悬浮于寡核苷酸贮存液中，再加入已充分混匀的Walker链溶液和发夹底物链混合液反应，磁洗涤后用寡核苷酸贮存液定容后与待测溶液、取代链溶液和内切酶溶液混合孵育，取上清液进行荧光检测沉淀滴加在磁性玻碳电极上进行电化学发光检测，优点是高灵敏度、高选择性以及操作简单快速。

技术领域

本发明涉及一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，尤其是涉及一种基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法。

背景技术

鼠伤寒沙门氏菌是一种常见的厌氧革兰氏阴性细菌，广泛分布于环境中，它可以通过受污染的家禽，鸡蛋，牛奶，鱼和肉制品传播给人类。据估计每年由鼠伤寒沙门氏菌感染的肠炎可造成100万人死亡。随着人们对食品安全意识的增强，快速，高效，简单，特异性的鼠伤寒沙门氏菌检测方法的开发已成为食品安全卫生检查领域的必然趋势。

DNA Walker是一种模仿天然的分子运动的动态DNA步行器，核酸能沿着由DNA组装而成的轨道运动，其显著的运动性、可控性和加工性，在生物传感器中得到了广泛的应用。而核酸构象引发链取代利用的是Turberfield课题组提出的“远端立足点”概念。“远端立足点”是一段间隔区域将立足点区域与链取代分支迁移区域连接起来，使立足点区域和链取代分支迁移区域隔离开，这个区域可以起到减缓分支迁移过程的反应速率的作用，其为调控立足点介导的链取代反应提供了更多种可能。将核酸构象引发链取代和DNA Walker理论相结合，通过改变DNA间隔区域实现链取代从而触发DNA步行器运行，实现对非核酸目标物的检测。

荧光免疫检测技术专一性强、灵敏度高，可用于测量含量很低的生物活性化合物，例如蛋白质、激素、药物及微生物等。LC Green Plus作为新型无毒荧光染料激发波长为440-470nm，发射波长为470-520nm，可与DNA双链结合产生荧光，作为荧光信号标签。电化学发光（ECL）检测方法已被应用于许多生物分析领域，与传统的激光诱导发光探测器相比，因为省去了激发激光和光学滤波器，因此ECL检测仪器的复杂性和成本要小得多。目前，国内外还没有公开任何关于基于核酸构象引发链取代从而驱动DNA Walker的双信号检测鼠伤寒沙门氏菌的电化学发光传感器的制备方法及其应用的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高灵敏度、高选择性以及操作简单快速的基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于核酸构象引发链取代驱动DNA Walker的双信号检测食源性致病菌的方法，包括以下步骤：

（1）将10~20 µmol/L的DNA Walker摆臂链溶液和10~20 µmol/L的含待测食源性致病菌适配体的保护探针溶液等体积混合后，置于95 ℃变形8~12 min之后缓慢降至室温，形成受保护的DNA Walker链溶液，其中摆臂链溶液和保护探针溶液的溶剂均为寡核苷酸贮存液；

（2）将3~5 µL 能嵌入双链间的核酸染料加入到500~600 µL 5~8 µM的发夹底物链溶液中，室温震摇 4~6 min，使核酸染料与DNA充分结合得到发夹底物链混合液；

（3）将1~2 mL 5~10 mg/mL 氨基化四氧化三铁和50~100 µL 戊二醛混合，在室温下搅拌50-70min，磁清洗后悬浮于2~5 mL 寡核苷酸贮存液中，再加入已充分混匀的50~60µL 5~10 µM 的受保护的DNA Walker链溶液和500~600 µL 5~8 µM 发夹底物链混合液，于35~38 ℃下反应20~40 min，磁洗涤后用寡核苷酸贮存液定容至2~5 mL；