[发明专利]木糖诱导生产N-乙酰神经氨酸的工程菌及其应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用木糖诱导生产N‑乙酰神经氨酸基因工程菌的构建及其应用。本发明在基因组上整合N‑乙酰氨基葡萄糖合成途径，并引入N‑乙酰氨基葡萄糖2‑差向异构酶基因bAGE以及N‑乙酰神经氨酸裂合酶基因shNAL，构建N‑乙酰神经氨酸合成途径，并敲除其分解代谢途径的关键基因nanTEK。同时对合成N‑乙酰神经氨酸所需的前体物质的代谢途径进行多拷贝强化并对部分旁路代谢途径进行敲除，得到一株N‑乙酰神经氨酸高产菌。摇瓶发酵36h N‑乙酰神经氨酸产量最高可达10.8g/L，生产强度可达0.3g/(L×h)，为目前报道的最高值，具有重要的工业应用价值。

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用木糖诱导生产N-乙酰神经氨酸基因工程菌的构建及其应用。

背景技术：

神经氨酸又称唾液酸，是一类含有九个碳原子具有吡喃糖结构的酸性氨基糖。N-乙酰神经氨酸(N-acetyl neuraminic acid,Neu5Ac)是唾液酸家族中最重要的一员，在生命活动过程中具有重要意义。Neu5Ac通常位于细胞膜表面糖蛋白和糖脂的末端，在细胞识别和信号传输中起着十分关键的作用。合理摄入Neu5Ac可以促进婴儿大脑发育，维持老年人大脑正常功能，预防老年痴呆。其衍生物扎那米韦已经被设计用来抑制甲型和乙型流感病毒，一些其他的衍生物也可被用来作为靶向治疗癌症的纳米载体的稳定剂，具有重大市场价值。

Neu5Ac的合成方法除了从燕窝、蛋黄等天然材料中提取，还有酶催化法、全细胞催化法和微生物发酵法等多种方法。多年前就有学者使用Neu5Ac裂合酶作催化剂，以N-乙酰氨基甘露糖(ManNAc)和丙酮酸作为底物，酶法合成Neu5Ac。后来研究人员发现ManNAc可以用N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶催化N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)生成，大大降低了酶法合成Neu5Ac的成本，但需要外源添加ATP等物质使得总体生产成本依然较高。而全细胞催化法虽然不需要外源添加辅助因子也不需要分离提纯酶，但是GlcNAc转化率均低于60％，大大增加了GlcNAc的回收成本以及Neu5Ac纯化分离的难度，其次酶催化法过程复杂，需要培养菌体、收集菌体、缓冲体系催化生产等多个步骤。这些问题极大的限制了工业上利用全细胞催化法生产Neu5Ac的发展。

因此微生物发酵法逐渐成为了生产Neu5Ac的热点方向。微生物发酵法可以直接以葡萄糖等廉价碳源作为底物，不需要添加任何其他前体物质或者辅助因子即可合成Neu5Ac，具有广阔的应用前景和市场价值。Zhang等人利用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)作为生产菌株，摇瓶发酵得到Neu5Ac产量为2.18g/L。Pang等人利用大肠杆菌(E.coli)作为生产菌株，摇瓶发酵120h得到Neu5Ac产量为14.23g/L，但生产强度仅有0.12g/(L×h)。以上产量均为目前报道的不同宿主细胞中的最高产量，但仍然无法满足工业生产需求。

为了获得更高生产强度的Neu5Ac生产菌株，本专利通过对大肠杆菌代谢途径进行理性改造，构建Neu5Ac合成途径，并通过合理分配碳源等代谢工程策略构建出一株Neu5Ac产量高、生产周期明显缩短的大肠杆菌基因工程菌。

发明内容：

针对上述存在问题，本发明目的是提供一种利用木糖诱导生产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌，及其构建与应用，并制定了相应的发酵过程控制方案，有良好的工业应用前景。

本发明技术方案概述如下：