[发明专利]一种同时检测基因突变与拷贝数变化的高通量方法

说明书

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种同时检测基因突变与拷贝数变化的高通量方法，包括：针对多个待检测位点或区域，分别设计一对正链探针和负链探针；使用所述正链探针和所述负链探针进行组合得到组合探针，并基于组合探针对待测DNA进行第一轮PCR扩增；对第一轮PCR扩增得到的产物，利用一对与二代测序平台测序引物相匹配的PCR引物对第一轮PCR扩增得到的产物进行第二轮PCR扩增；对第二轮PCR扩增得到的产物进行高通量双端测序；对高通量双端测序数据进行目标位点基因型判定及拷贝数分析。解决了现有技术中无法做到基因区域点突变及拷贝数变异在一种技术中同时检测的问题。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种同时检测基因突变与拷贝数变化的高通量方法。

背景技术

基因是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。除了部分病毒遗传物质是RNA外，几乎所有非病毒生物的遗传物质是DNA。不同物种都有其特异的基因序列，因此通过检测样品中的基因序列可以判断样品中存在的生物种性。细胞在生命过程中，基因通过DNA转录成mRNA，然后细胞以mRNA为模板翻译出有生物活性的蛋白质分子，从而将贮存在DNA序列中遗传信息表现出来。基因一方面能能忠实地复制自己，以保持生物的基本特征；另一方面基因在复制过程中也会出现差错产生“突变”。这种突变包括点突变、大片段缺失/重复(称为拷贝数多态，CNV)、基因倒位或基因易位等。有的突变会严重影响关键基因的功能从而导致疾病，由于受到选择作用，这类突变在群体中的频率非常低，而相当一部分突变由于并未严重影响基因功能或影响的基因并不对个体造成生存压力，他们在群体中会保留下来并由于受到随机漂变以及奠基者效应发生频率的改变，从而成为群体中的一种遗传多态，对于单碱基或寡碱基改变的多态被称之为单核苷酸多态(SNP)，而对于大区段的缺失或重复多态被称之为拷贝数多态(CNP)。

遗传多态以及基因突变分析是研究基因功能以及遗传性疾病的致病机理最常见的遗传分析方法。因此，基因鉴定、基因表达分析、DNA甲基化分析、突变筛查、SNP分型、CNP分型以及CNV检测是重要的分子遗传学研究手段，而且在临床分子诊断上也有着广泛的应用(Varela MA et al,2010)。正因为这些遗传分析的重要性，对于每一种分析，科学家及工程师们都开发出了多种检测方法。

但申请人在实际应用中发现现有技术的手段仍然存在如下技术问题：早期的检测方法主要针对有限的目的片段分析。用于SNP检测的方法如TaqMan探针等位基因检测技术、限制性内切酶反应(RFLP)、高分辨率融解曲线反应、单碱基延伸技术等。中小通量CNV的检测方法主要包括实时定量PCR、FISH、多重连接探针扩增技术(MLPA)等。上述方法灵活性很高，但最大的缺陷是通量太低，往往需要结合不同技术对基因区域位点及拷贝数进行检测，对于需要检测大量基因位点的研究项目或诊断需求时就显得无能为力了。

微阵列芯片(Microarray)以高密度探针阵列为特征，利用分子杂交原理,将各种处理过的荧光标记样本与微阵列探针进行杂交，然后经过洗涤去除非特异杂交信号，最后用扫描仪进行荧光检测，根据荧光信号的强弱以及荧光信号所在的阵列位置确认目的基因相关的信号量(Maskos U et al,1992)。微阵列芯片最大的优势就是高通量，能够在整个基因组水平上分析基因的变化，但其缺陷是由于普遍存在非特异性杂交，定量的准确性较差，同时需要昂贵的杂交及扫描仪器，成本高而且定制芯片时间长费用高，对未知基因无法实现检测。

下一代测序技术的出现给基因检测领域带来个革命性的变化。定制合成混合寡核苷酸(探针)在液相中对剪切的基因组DNA样本进行杂交捕获是一种可以捕获较大区域的方法。高通量测序技术的最大的优势就是通量很大。这种富集技术主要用于候选基因的突变检测，但由于这些富集过程在一定程度上消除了产物与原始模板量的正比关系，因此不能准确实现对富集的候选基因片段进行定量分析，如表达量以及拷贝数分析。

发明内容

本申请实施例通过提供一种同时检测基因突变与拷贝数变化的高通量方法，解决了现有技术中无法做到基因区域点突变及拷贝数变异在一种技术中同时检测的问题。