[发明专利]一种DNA复合水凝胶及其制备方法

说明书

本申请涉及生物技术领域，具体涉及DNA复合水凝胶及其制备方法。本申请将质量分数为0.5％～4％黏土、质量分数为0.2％～30％的含功能化基团的高分子化合物、浓度10～400ng/μL的DNA模板在较低温度下混合均匀，较高温度下聚合，从而形成了DNA复合水凝胶。本申请的DNA复合水凝胶既可以保护DNA模板，又可以提高无细胞蛋白表达中DNA模板的局部有效浓度，进而提高了蛋白产量。同时该水凝胶可以重复使用数次，进一步降低了反应成本。

技术领域

本申请涉及生物技术领域，具体涉及用于无细胞蛋白表达的DNA复合水凝胶及其制备方法。

背景技术

现有的蛋白质制备方法多是以细胞作宿主在活细胞里进行合成的，但其具有很多缺点：操作繁琐、周期长、合成的蛋白质种类极其有限等。无细胞蛋白质合成(Cell-freeProtein Synthesis,CFPS)系统是以外源DNA或mRNA为模板，人工添加所需原料和能源物质，以细胞提取物为条件合成蛋白的体外基因表达系统，可以突破细胞限制，方便快捷的表达各种蛋白质。详言之，CFPS是以DNA为模板，在RNA聚合酶及转录因子等组分作用下，转录出相应的mRNA；以mRNA为模板，利用系统中的核糖体、调控因子、氨基酸底物、tRNA、能源物质等翻译取得合成蛋白质。CFPS相对于体内系统的独特优势在于直接利用可通过聚合酶链式反应(PCR)扩增线性DNA模板(linear DNA expression templates,LETs)的能力，且无需将目的基因构建到表达载体上，显着简化了CFPS的工作流程、缩短了蛋白质合成时间。

基于LETs的CFPS成为高通量生产和蛋白质筛选的有效工具，它已经开始在各种领域证明其有用性，例如：蛋白质微阵列、克隆的功能基因组学等。但是由于与质粒相比，LETs对无细胞环境中天然核酸酶的易感性增加，导致了其具有较短寿命和较低的反应产率。

为了提高LETs在CFPS中的寿命和蛋白质的反应产率，现有技术所采取的方法包含：(1)抑制或降低核酸酶的活性，保护线性DNA免受核酸酶的降解作用，提高模板的局部浓度。(2)使用已敲除编码核酸内切酶E基因(RNase E)的菌株制备细胞提取物，延迟了mRNA分子被降解，来自PCR扩增得到的LETs表达的蛋白质水平变得与常规基于质粒的反应相当，但是存在的问题是该菌株生长缓慢，费时。(3)通过设计特殊引物将DNA线性片段形成了类似于质粒的环形DNA分子，提高了目的基因片段对核酸外切酶的抵御能力，但是成本昂贵。(4)Luo课题组将DNA水凝胶系统应用于CFPS，主要是将线性模板DNA分子与X形DNA(X-DNA)衔接，以产生用于组合的无细胞转录和翻译系统的DNA水凝胶；在小麦胚芽无细胞系统中，与可溶性DNA模板相比，此方法使得蛋白质产量提高了300倍，然而X-DNA合成成本昂贵。Luo课题组又发明了一种成本低廉的黏土水凝胶，通过质粒和黏土的静电相互作用将质粒吸附在表面，保护了质粒免受体系中核酸外切酶的作用，并且增强了转录和翻译过程，进而提高了蛋白的表达。该黏土水凝胶虽然价格低廉，但是具有触变性，在震荡过程中容易破碎，限制了该水凝胶模板的重复利用。

基于上述缺点，本发明提供了一种DNA复合水凝胶的制备方法。该方法是在黏土存在的条件下，以氢键或配位作用与高分子聚合物形成物理交联的水凝胶，同时以静电相互作用负载DNA模板。该DNA复合水凝胶机械强度较高，可实现水凝胶模板的重复利用，进一步降低了反应成本

发明内容

针对上述缺点，本发明提供了一种DNA复合水凝胶的制备方法。

本发明的目的是提供DNA复合水凝胶。

本发明的再一目的是上述DNA复合水凝胶的制备方法。

本发明的DNA复合水凝胶通过以下步骤制备而得：

将质量分数为0.5％～4％黏土、质量分数为0.2％～30％的含功能化基团的高分子化合物、浓度10～400ng/μL的DNA模板在较低温度下混合均匀，较高温度下聚合，从而形成了DNA复合水凝胶。