[发明专利]一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针及检测方法

说明书

本发明涉及动物卫生技术领域。本发明提供了一组能够特异性检测蜜蜂克什米尔病毒的实时荧光RT‑PCR的引物和探针，并利用所述的引物组合探针对实时荧光RT‑PCR的反应体系和反应程序进行优化得到的非诊断目的的检测方法。本发明的检测方法具有以下优点：(1)良好的特异性和敏感性性：对蜜蜂克什米尔病毒的检测具有高度特异性，与其它蜜蜂病毒无交叉反应，且重复性好；(2)灵敏度高：灵敏度能达到约8拷贝/μL；(3)操作简单、快速，整个反应可在60分钟内完成。本发明可用于非诊断为目的的蜜蜂克什米尔病毒的检测及其与其他蜜蜂病毒病的鉴别，对于保障我国养蜂业和维护自然生态的健康发展具有重要意义。

技术领域

本发明涉及动物卫生技术领域，尤其涉及一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针及其检测方法。

背景技术

克什米尔蜜蜂病毒(Kashmir bee virus，KBV)最初于1977年从饲喂了患病东方蜜蜂Apis cerana病毒液的西方蜜蜂体内被分离鉴定出来，因为这些东方蜜蜂来源于克什米尔地区，所以研究者就用此地名给这种病毒命名。目前，除了印度和澳大利亚以外，KBV在世界各地的西方蜜蜂群中陆续被报道，但是，人们对于中国境内KBV的传播与流行情况认识有限。

KBV与其他蜜蜂病毒一样通过垂直传播和水平传播两种途径在蜂群内扩散。KBV首先发现于成蜂体内，病毒粒子在进入成蜂血淋巴后几天内就会导致宿主死亡，因此它被认为是毒力最强的蜜蜂病毒之一。KBV会与其他病毒如SBV共同感染蜜蜂，由于KBV具有较强的快速扩增能力，通常在被多种病毒感染的蜜蜂体内居于主导地位，例如近年间，欧美诸国的西方蜜蜂Apis mellifera蜂群在越冬期间损失的现象愈发严重，发生的频率和死亡蜜蜂的数量也都有所上升。造成这种现象的原因众说纷纭，其中病毒及病毒与蜂螨间的协同作用被认为是导致蜜蜂死亡和蜂群崩溃的主要诱因之一，而KBV也作为导致蜜蜂死亡的罪魁祸首。该病毒自发现以来就开始在世界范围内传播流行，给蜜蜂及其他昆虫造成巨大损失，已成为养蜂业的主要危害。

目前对蜜蜂病毒病的检测主要采用免疫学检测和核酸分子检测技术。免疫检测是目前一种常用的快速检测病毒的方法，但是蜜蜂很多病毒之间具有高度的基因同源性，应用免疫学技术会造成蜜蜂病毒检测特异性较差，很难对蜜蜂病毒病进行准确诊断。得益于分子生物学的发展，病毒的检测手段也发生了变革，其中普通PCR检测被认为是克服蜜蜂病毒检测障碍的有效手段。对比于传统的物理学和血清学检测，自从Stoltz等(1995)开发出第一对蜜蜂病毒的普通PCR引物以来，KBV的检测就变得方便经济很多。近年来，TaqMan探针法与SYBR Green荧光法进行KBV病毒定量PCR检测的手段也已开发利用，其灵敏度相比于传统的PCR方法高出约1000倍。但是IAPV病毒被确定以来，其与KBV的关系就一直纠缠不清。由于KBV和IAPV具有高度的相似性，核苷酸序列一致性高达97％，以致采用新的IAPV PCR引物和方法对法国境内的西方蜜蜂重新进行病毒筛查，结果只有一个蜜蜂样本呈现KBV阳性，这与之前的结果大相径庭，最终分析显示，之前的KBV属于IAPV，从而证实了用以检测KBV引物的特异性不强，不能准确区分KBV和IAPV。因此，急需一种特异性更强，敏感度更高的检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组合和探针及其检测方法来弥补现有技术的不足，来保障我国养蜂业和自然生态的健康发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组合和探针及其检测方法。解决了现有技术中检测蜜蜂克什米尔病毒特异性差，检测结果不准确等问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针，包括上游引物KBV-F、下游引物KBV-R及TaqMan探针KBV-P；所述上游引物KBV-F的序列如：SEQ ID NO.1所示；所述下游引物KBV-R的序列如：SEQ ID NO.2所示；所述TaqMan探针KBV-P的序列如：SEQ ID NO.3所示。

作为优选，所述TaqMan探针KBV-P的5'端采用荧光基团HEX进行修饰，3'端采用BHQ1进行修饰。