[发明专利]一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针及检测方法

权利要求书

1.一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针，其特征在于，包括上游引物KBV-F、下游引物KBV-R及TaqMan探针KBV-P；所述上游引物KBV-F的序列如：SEQ ID NO.1所示；所述下游引物KBV-R的序列如：SEQ ID NO.2所示；所述TaqMan探针KBV-P的序列如：SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针，其特征在于，所述TaqMan探针KBV-P的5'端采用荧光基团HEX进行修饰，3'端采用BHQ1进行修饰。

3.一种如权利要求1或2所述的一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针扩增得到的目的片段，其特征在于，所述扩增得到的目的片段的大小为190bp，序列如SEQ ID NO.4所示。

4.一种非疾病诊断目的检测蜜蜂克什米尔病毒的方法，其特征在于，采用实时荧光RT-PCR进行检测。

5.根据权利要求4所述的一种非疾病诊断目的检测蜜蜂克什米尔病毒的方法，其特征在于，所述实时荧光RT-PCR检测的反应体系包括如下组分和含量：10×RT-PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，2.5mmol/L dNTPs 1.5μL，10μmol/L上下游引物KBV-F/KBV-R各0.5μL，10μmol/L探针KBV-P 1.0μL，5U/μL DNA聚合酶0.5μL，5U/μL逆转录酶0.5μL，40U/μL RNA酶抑制剂0.5μL，样品RNA 2μL，然后加入水9.0μL，使反应总体积为20.0μL。

6.根据权利要求5所述的一种非疾病诊断目的检测蜜蜂克什米尔病毒的方法，其特征在于，所述实时荧光RT-PCR检测的反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃变性15s，61℃退火30s，共40个循环。

7.根据权利要求6所述的一种非疾病诊断目的检测蜜蜂克什米尔病毒的方法，其特征在于，所述61℃退火为单点荧光检测。

8.根据权利要求7所述的一种非疾病诊断目的检测蜜蜂克什米尔病毒的方法，其特征在于，所述检测结果的判定标准为：在实验有效的情况下，样品无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含蜜蜂克什米尔病毒；待测样品Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有蜜蜂克什米尔病毒；待测样品Ct值＞35，则对该样品重复检测，重复检测结果无Ct值则该样品不含蜜蜂克什米尔病毒；重复检测结果有Ct值则该样品中含有蜜蜂克什米尔病毒。

9.根据权利要求4～8任意一项所述的一种非疾病诊断目的检测蜜蜂克什米尔病毒的方法，其特征在于，所述实验有效的情况为：阴性对照无Ct值且无扩增曲线，同时阳性对照Ct值≤35，并且出现典型的扩增曲线，说明实验为有效实验。