[发明专利]一种CRSPR-cas13a驱动的基于双酶信号扩增策略的RNA快速检测方法

说明书

本发明公开了生物检测技术领域的一种CRSPR‑cas13a驱动的基于双酶信号扩增策略的RNA快速检测方法，该基于双酶信号扩增策略的RNA快速检测方法包括如下步骤：样品收集；样品的处理；磁分离探针的组装；靶序列特异触发的一级酶促信号扩增及分离；二级酶促信号放大及信号给出；目的核酸序列检测信号给出，本发明的核酸检测序列可控，可根据实际需求，设计合适的引导序列，以控制识别的靶序列，具有极高的特异性和极高的灵敏度，具有较好的显色效果，可以在定性的情况下不依赖分析仪器，肉眼即可判断出检测结果，分离速度快，同时对仪器要求简单，可以同时处理多组样品，从而节省了人力和成本。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体为一种CRSPR-cas13a驱动的基于双酶信号扩增策略的RNA快速检测方法。

背景技术

RNA可以作为有效的生物标志物应用于疾病诊断。然而在疾病发病早期或潜伏期，体液中RNA含量较低，这对检测方法的灵敏度提出了极高的要求。经典的rt-PCR检测方法耗时费力，依赖于荧光定量PCR仪等精密设备，且有一定假阳性几率出现。近年来，基于CRSPR-CAS13a的高灵敏检测方法被提出，但是，现有方法依然依赖荧光定量PCR仪等设备，操作过程复杂，成本较高，这极大的影响了疾病的早期排查。高灵敏、高特异、且操作简便的RNA检测方法短缺为相关疾病的临床诊断带来了极大挑战。因此，发展快速、高效、性能可靠的RNA检测分析方法具有重要的科研及临床意义。

传统上，RNA检测主要通过反转录和PCR技术。这些技术要么设备笨重且昂贵，要么样品处理过程复杂，并不利于临床使用和进一步普及。酶促比色法是一种科研及临床上常用的分析检测方法，广泛运用于免疫诊断、病原微生物筛查及环境监控等领域。得益于酶促比色法原理的优越性，该方法具有较宽的检测范围、高灵敏度、反应体系可控等特点。然而，在RNA检测中酶促比色法优势并不明显，具体原因有：(1)生物体液成分相对复杂，游离核酸等可能会对检测造成干扰；(2)临床上可获得的生物体液有限且RNA含量较低，纯化后的核酸序列的浓度难以达到检测范围。综上所述，研发新型CRSPR-cas13a驱动的基于双酶信号扩增策略的RNA快速检测技术具有重要的临床意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CRSPR-cas13a驱动的基于双酶信号扩增策略的RNA快速检测方法，以解决上述背景技术中提出的生物体液成分相对复杂，游离核酸等可能会对检测造成干扰和临床上可获得的生物体液有限且RNA含量较低，纯化后的核酸序列的浓度难以达到检测范围的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种CRSPR-cas13a驱动的基于双酶信号扩增策略的RNA快速检测方法，该基于双酶信号扩增策略的RNA快速检测方法包括如下步骤：

S1：样品收集：包括动物或人细胞培养液收集、动物或人血液样品收集、动物或人尿液样品收集、动物或人唾液样品收集；

S2：样品的处理：包括样品的前处理和样品中RNA的获取；

S3：磁分离探针的组装：包括配缓冲溶液、氨基修饰的信号探针和羧基磁珠进行活化和氨基修饰的信号探针和羧基磁珠结合；

S4：靶序列特异触发的一级酶促信号扩增及分离：将样品中获取的RNA加入到100μL修饰过信号探针磁珠中，并同步加入10nM纯化的LbuCas13a，10nM crRNA，并充分混匀，室温放置10-30min进行孵育，将孵育好的样品置于磁分离架，静置，收集溶液部分；

S5：二级酶促信号放大及信号给出：将步骤S4制得的一级反应产物即回收液体部分50ul，加入到96孔板，与此同时加入50ul反应底物，反应10-30min，同时注意观察颜色变化，避免错过最佳测量时机；

S6：目的核酸序列检测信号给出。

优选的，所述步骤S1中的样品收集包括以下步骤：