[发明专利]一种CRSPR-cas13a驱动的基于双酶信号扩增策略的RNA快速检测方法

权利要求书

1.一种CRSPR-cas13a驱动的基于双酶信号扩增策略的RNA快速检测方法，其特征在于：该基于双酶信号扩增策略的RNA快速检测方法包括如下步骤：

S1：样品收集：包括动物或人细胞培养液收集、动物或人血液样品收集、动物或人尿液样品收集、动物或人唾液样品收集；

S2：样品的处理：包括样品的前处理和样品中RNA的获取；

S3：磁分离探针的组装：包括配缓冲溶液、氨基修饰的信号探针和羧基磁珠进行活化和氨基修饰的信号探针和羧基磁珠结合；

S4：靶序列特异触发的一级酶促信号扩增及分离：将样品中获取的RNA加入到100μL修饰过信号探针磁珠中，并同步加入10nM纯化的LbuCas13a，10nM crRNA，并充分混匀，室温放置10-30min进行孵育，将孵育好的样品置于磁分离架，静置，收集溶液部分；

S5：二级酶促信号放大及信号给出：将步骤S4制得的一级反应产物即回收液体部分50ul，加入到96孔板，与此同时加入50ul反应底物，反应10-30min，同时注意观察颜色变化，避免错过最佳测量时机；

S6：目的核酸序列检测信号给出。

2.根据权利要求1所述的一种CRSPR-cas13a驱动的基于双酶信号扩增策略的RNA快速检测方法，其特征在于：所述步骤S1中的样品收集包括以下步骤：

A1：动物或人细胞培养液收集：细胞培养液为DMEM，添加体积分数为10％小牛血清(FCS)，细胞用胰蛋白酶消化，转至细胞培养皿，在37℃、5％CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24h，使细胞汇合50％-60％，然后换用无血清DMEM培养液培养24-48h，回收该无血清DMEM细胞培养液，短期内4℃保存，长期放-80℃保存；

A2：动物或人体液样品收集：动物或人静脉抽血，加入抗凝剂，离心去除血液中的细胞成分，得到血浆；或待血液凝固后取血清亦可，得到的血样样品-80℃保存或立即使用，把动物或人的尿液收集到集尿器，得到尿液样品，尽量避免外界对尿液样品的污染，立即使用或存于-80℃备用；

A3：细胞收集：贴壁及组织细胞通过0.2％胰蛋白酶消化处理1分钟后，1000转/分钟离心5分钟获得，若不立即使用，应冻存到负八十或液氮中，非贴壁细胞直接离心操作，若不立即使用，应冻存到负八十冰箱或液氮中。

3.根据权利要求1所述的一种CRSPR-cas13a驱动的基于双酶信号扩增策略的RNA快速检测方法，其特征在于：所述步骤S2中的样品处理包括以下步骤：

B1：样品的前处理：血液样品需在加入抗凝剂的前提下，1500转/分钟离心30分钟去除细胞及碎片，获得血浆成分，尿液及细胞培养液一般需要浓缩后进行下部操作；

B2：RNA提取：经处理后的样品选用商用试剂盒或者通过trizol法获得RNA。