[发明专利]一株二氢吡啶单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

说明书

一株二氢吡啶单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。二氢吡啶单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC02，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19177。本发明合成了二氢吡啶半抗原，制备了二氢吡啶完全抗原，并将它与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，通过PEG方法与骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法的筛选和三次亚克隆，得到杂交瘤细胞株ABC02。此细胞株分泌的单克隆抗体，对二氢吡啶具有较好的特异性和检测灵敏度（IC₅₀为0.35 ng/mL），可制成用于检测二氢吡啶的试剂盒，具有实际应用价值。

技术领域

本发明涉及一株二氢吡啶单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术

二氢吡啶为镇痛性化学保定药，主要用于马、牛、羊等动物的镇静与镇痛。研究表明，二氢吡啶在食源性动物组织中的残留对消费者造成的健康风险很大，长期使用含有二氢吡啶残留动物源食品可能会耐药性。因此，建立有效的二氢吡啶残留检测方法，对有效控制牛奶产品中二氢吡啶的残留，保障广大人民群众的身体健康，具有深远的意义。

对于兽药二氢吡啶残留，目前缺少对其残留检测方法，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对二氢吡啶的高效、快速的检测方法。酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在兽药残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测二氢吡啶的前提是得到对二氢吡啶具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对二氢吡啶具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一株二氢吡啶单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的抗体对二氢吡啶具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立二氢吡啶的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株二氢吡啶单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC02，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19177。

二氢吡啶单克隆抗体，由所述保藏编号为CGMCC No.19177单克隆细胞株ABC02分泌产生。

所述二氢吡啶单克隆抗体的应用：建立二氢吡啶含量的免疫检测方法，应用于食品中二氢吡啶的检测。

所述食品具体为乳品和其他含有二氢吡啶的食品。

所述二氢吡啶免疫原的制备方法基本步骤为：

（1）二氢吡啶半抗原的制备：将570 mg二氢吡啶加入溶于无水吡啶（5 mL）的600mg琥珀酸酐中，60℃加热反应6h。停止加热后冷却至室温，将反应物转移到置于冰水浴中的20mL10%的盐酸中，有大量白色沉淀析出，用去离子水洗涤数次，干燥后得到白色的固体，即为二氢吡啶半抗原。半抗原合成路线见杂交瘤细胞株ABC02的制备。

（2）免疫原二氢吡啶-BSA的制备：称取1.46 mg的二氢吡啶半抗原将其溶解在600μL DMF中，然后加入2.62 mg EDC，1.49 mg NHS，该混合物在室温搅拌6 h，得到反应液A；称取5 mg BSA，溶解于0.1M硼酸盐缓冲液中，得到溶液B；随后，逐滴将A液加入到B液中，室温反应8 h，即得偶联物二氢吡啶-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原二氢吡啶-BSA。

本发明的二氢吡啶单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选方法，主要包括以下步骤：