[发明专利]一种用于扩增B淋巴细胞免疫组库的引物组及其应用

权利要求书

1.一种用于扩增B淋巴细胞免疫组库的引物组，其特征在于，所述引物组包括一组正向引物和一组反向引物；

所述正向引物从5′端到3′端包括依次相连的接头序列1、条码序列1和针对免疫球蛋白可变区互补决定区3的特异性序列；

其中，所述针对免疫球蛋白可变区互补决定区3的特异性序列如SEQ ID NO.1～12中的任意一项所示；

所述反向引物从5′端到3′端依次为接头序列2、条码序列2和针对免疫球蛋白基因恒定区的特异性序列。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述针对免疫球蛋白基因恒定区的特异性序列如SEQ ID NO.13～17所示。

3.根据权利要求1或2所述的引物组，其特征在于，所述接头序列1的核苷酸序列为CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAG；

优选地，所述接头序列2的核苷酸序列为CTACACGACGCTCTTCCGATCT；

优选地，所述条码序列1由6～8个核苷酸组成；

优选地，所述条码序列2由6～8个核苷酸组成。

4.一种用于分析B细胞受体互补决定区3序列的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1～3任一项所述的引物组。

5.一种利用如权利要求1～3任一项所述的引物组扩增B淋巴细胞免疫组库的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)提取样本中的RNA；

(2)将步骤(1)中所得的RNA和所述引物组中的反向引物混合，进行逆转录合成得到cDNA；

(3)以步骤(2)所得的cDNA为模板，加入所述引物组中的正向引物，进行多重PCR扩增，纯化回收后得到PCR产物；

(4)对所述PCR产物添加测序索引和接头得到BCR文库，纯化；

(5)对所述BCR文库进行定量分析和测序，确定CDR3区域的起始和结束位置，分析CDR3区域的长度分布及氨基酸使用偏好。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述样本包括IgA肾病患者的血液样本；

优选地，步骤(2)所述逆转录的反应体系中还包含RNase抑制剂、逆转录酶和dNTPs；

优选地，步骤(2)所述逆转录的反应体系中，反向引物的总摩尔浓度为10～12mM；

优选地，步骤(2)所述逆转录的反应程序为：42℃孵育1h，然后在70℃加热失活5min，4℃下保存。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述多重PCR的反应程序为：95℃初始变性15min，然后在94℃变性15s，60℃退火3min，在72℃延伸5min，4℃下保存；

优选地，步骤(3)所述多重PCR的反应体系中，所述正向引物的总摩尔浓度为10～12mM。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述添加测序索引和接头的反应条件为：

98℃预热1min，然后分别在98℃下20s、65℃下30s和72℃下30s进行25个循环，最终在72℃下延伸7min；

优选地，步骤(5)所述定量分析和测序方法为：用Agilent 2100生物分析仪和Qubit2.0对所述BCR文库进行定量分析，然后用Illumina测序仪进行测序。