[发明专利]一种沉积物石蜡切片的制作方法

说明书

本发明公开了一种沉积物石蜡切片的制作方法。本方法先用戊二醛固定沉积物样本，然后经过梯度乙醇脱水、透明处理、浸蜡包埋、切片、烤片，烤片后迅速用聚乙烯醇缩甲醛处理及用离子加湿器吹扫，这可以在切片表面形成一层膜，从而将切片细节保护在内。本方法切出的沉积物切片，结构完整，显示清晰，对观察微生物中微生物形态结构等具有明显的增强效果。

技术领域

本发明属于石蜡切片的制作领域，具体涉及一种沉积物石蜡切片的制作方法。

背景技术

沉积物是水体中重要的环境信息载体，包含丰富的矿物质、有机质以及微生物等。微生物是沉积物中生物量最大的类群，其形态、结构及其生长环境等是影响其环境生态行为的重要因素，因此，对沉积物中微生物进行原位观察就显得尤为重要，沉积物切片可以较好地实现这个目标，然而相关的技术较为缺乏。

沉积物切片目前主要以冰冻切片为主，但目前冰冻切片技术主要应用于常规动植物组织等，由于沉积物颗粒的粘连性较差，远远低于常规动植物组织的粘连性，因此沉积物冰冻切片一般较脆，容易破碎，而且冰冻切片在进行扫描电镜观察时受沉积物介质的影响较大，难以观察到较清晰的微生物形态和结构。

石蜡切片是目前应用得最广泛的组织学常规制片技术，一般用来观察细胞组织形态结构，可长期保存。目前尚未有研究将石蜡切片技术应用于沉积物这种介质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种沉积物石蜡切片的制作方法，用于后续的扫描电镜成像观察与研究。本发明通过将石蜡切片引入沉积物中微生物的扫描电镜成像中，以此观察沉积物中的微生物，尤其是长线状微生物。

本发明的沉积物石蜡切片的制作方法，包括以下步骤：

a.取样：用吸管插取沉积物柱状样本，然后用液氮速冻；

b.固定：切开并移除吸管，加入体积分数2.5％戊二醛水溶液固定沉积物柱状样本，在黑暗中固定过夜；

c.浸洗：用pH7.2的0.1M PBS溶液浸洗固定后的样本三次；

d.脱水：用梯度乙醇脱水处理；

e.透明处理：先用体积比为1:1的二甲苯/乙醇处理一次，再用二甲苯处理两次；

f.浸蜡包埋：用65℃的石蜡浸蜡处理三次，然后置于包埋盒中冰上包埋；

g.二次包埋：将包埋后的沉积物块修整至切面小于8mm×8mm，随后重复一次步骤f的操作进行二次包埋；

h.修块及切片：将切面修整至小于1cm×1cm后，使用手动轮转式病理切片机连续切片，并在40℃水浴中进行展片，再用多聚赖氨酸包埋的细胞爬片进行贴片；

i.烤片：将切片竖直置于65℃烘箱中烤片；

j.贴膜：将切片在体积分数0.3％的聚乙烯醇缩甲醛水溶液中蘸一下，然后用离子加湿器吹切片使其在表面形成一层微孔滤膜；

k.脱蜡：用二甲苯脱蜡两次；

l.置换：用乙醇置换二甲苯两次，然后用叔丁醇置换二甲苯一次；

m.用冷冻干燥机冻干样本，然后进行扫描电镜观察。

优选，所述的步骤c的浸洗，每次10min；

优选，所述的步骤d的用梯度乙醇脱水处理，是依次用体积分数70％乙醇水溶液、体积分数85％乙醇水溶液、体积分数95％乙醇水溶液、乙醇、乙醇进行脱水处理，每次脱水处理30min。

优选，所述的步骤e，具体为：先用体积比为1:1的二甲苯/乙醇处理30min，再用二甲苯处理两次，每次30min