[发明专利]番茄根结线虫病和烟草花叶病毒病抗病基因标记及方法

权利要求书

1.一种检测番茄根结线虫病抗病基因的引物在鉴定番茄根结线虫病抗性中的应用，其特征在于，所述引物为InMi1-F、InMi1-R，在抗病材料中扩增出100bp片段，在感病材料中扩增出155bp片段，其中，

InMi1-F：AAATTATGAAAACAAGTATTTGGAG；

InMi1-R：AGAACAGTAAAAAGATGTAAGAACC。

2.一种检测番茄根结线虫病抗病基因的引物在鉴定番茄根结线虫病抗性中的应用，其特征在于，所述引物为InMi2-F、 InMi2-R，在抗病材料中扩增出97bp片段，在感病材料中扩增出152bp片段，其中，

InMi2-F：ATTATGAAAACAAGTATTTGGAGT；

InMi2-R：GAACAGTAAAAAGATGTAAGAACC。

3.一种采用权利要求1或2所述的引物进行番茄根结线虫病抗病基因鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取番茄叶片基因组DNA；

（2）利用权利要求1或2中的引物对步骤（1）提取的基因组DNA进行PCR扩增；

（3）对步骤（2）扩增后的产物进行8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳；

（4）根据步骤（3）的结果判断番茄的抗感性；InMi1-F、InMi1-R在抗病材料中扩增出100bp片段，在感病材料中扩增出155bp片段；InMi2-F、 InMi2-R在抗病材料中扩增出97bp片段，在感病材料中扩增出152bp片段。

4.根据权利要求3所述的进行番茄根结线虫病抗病基因鉴定的方法，其特征在于，所述步骤（1）包括以下步骤：

① 取新鲜叶片30mg放入2ml的离心管中，加入一个直径4mm的钢珠，盖紧盖子，将其放入液氮中60s，然后利用组织研磨仪磨样；

② 在磨好的样中加入600µl 2%的CTAB提取液，55℃水浴20min，每隔5min摇晃一次；

③ 12000rpm离心5min，吸取350µl上清于干净的1.5ml的离心管中，加入250µl氯仿和异戊醇混合物，充分混匀；氯仿和异戊醇混合物中氯仿和异戊醇的体积比为24：1；

④ 13000rpm离心2min，取250µl上清于另一1.5ml的离心管中，加入550µl无水乙醇，放-20℃冰箱2h；无水乙醇提前在-20℃条件下预冷；

⑤ 12000rpm离心10分钟，倒掉上清液，室温放置；

⑥ 待离心管中无酒精味时，加入100µl ddH₂O溶解DNA；放4℃冰箱。

5.根据权利要求3所述的进行番茄根结线虫病抗病基因鉴定的方法，其特征在于，所述步骤（2）的扩增包括以下步骤：

进行PCR扩增时采用的反应体系为15μL体系，其中提取番茄材料的叶片基因组DNA 1μL，2*Taq MasterMix 7.5μL，正反引物各1μL，加入灭菌的超纯水至15μL；PCR 扩增时反应程序为：94℃预变性2min；然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s， 58℃退火30s，72℃延伸45s；最后延伸2min，置于4℃保存。