[发明专利]基于CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除猪miR-155基因的细胞系及构建方法

说明书

本发明提供一种基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的敲除猪miR‑155基因的细胞系及其构建方法，涉及基因工程技术领域，本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的敲除猪miR‑155基因的细胞系及其构建方法，该细胞系采用以下步骤制备：根据猪miR‑155基因的前体序列及成熟体序列设计优选sgRNA向导序列；将sgRNA39 F和sgRNA39 R序列退火形成双链DNA，将DNA与线性化pKLV2‑U6gRNA5(gGFP)‑PGKBFP2AGFP‑W载体连接获得重组质粒，与慢病毒包装质粒PSPXA2、PMD2.G稳定转染HEK293T细胞包装成慢病毒；收集浓缩病毒感染稳定表达Cas9蛋白的猪肺泡巨噬细胞系（3D4/21），通过无限稀释或流式分选的方法挑取单克隆细胞，扩大培养成细胞系，建立猪miR‑155基因敲除的细胞系，为进一步进行抗病候选基因miR‑155的功能研究提供有效的细胞研究模型。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种基于CRISPRCas9基因编辑系统的敲除猪miR-155基因的细胞系及构建方法。

背景技术

CRISPR/Cas系统是由RNA介导的对DNA修饰的基因编辑工具，该技术可以对基因组特定位点进行缺失、插入、修复等靶向编辑，是目前基因组编辑领域最受欢迎的新技术。CRISPR/Cas系统是人们在古细菌和细菌中发现的一种获得性免疫机制。CRISPR/Cas系统有三种类型：TypeⅠ、TypeⅡ和TypeⅢ，其中仅存在于细菌的TypeⅡ系统只需要一个Cas9蛋白来切割DNA双链，由于其简易性和可操作性，TypeⅡ系统已被改造为最成功的人工核酸酶，是最有力的基因编辑工具，成为基因编辑领域最炙手可热的技术。

存在机体组织微环境中的巨噬细胞是重要的免疫细胞，具有吞噬、抗原加工与递呈、免疫调节等生理功能，在机体先天性免疫和获得性免疫中发挥重要作用。猪体受到细菌（猪沙门氏菌、副猪嗜血杆菌）或病毒（猪蓝耳病）感染后，常常首当其冲受到影响的是巨噬细胞，比如肺泡巨噬细胞。大量研究数据表明细菌（比如副猪嗜血杆菌）感染削弱巨噬细胞的免疫力导致猪对细菌易感，病毒（猪蓝耳病）感染抑制巨噬细胞的功能形成严重免疫抑制导致猪体对其它病毒性疾病和细菌性疾病易感性明显增加。

miR-155基因是重要的抗病候选基因。miR-155促进机体免疫细胞分化，调控机体炎症反应和免疫应答，在机体抵抗感染中发挥重要作用。目前尚未有关于猪miR-155基因的敲除载体及猪miR-155基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系（3D4/21细胞系）模型的相关报道。

发明内容

（一）解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9基因编辑系统特异性靶向敲除猪miR-155基因的细胞系及其构建方法，本发明为进一步对抗病候选基因miR-155的功能研究提供有效的细胞研究模型。

（二）技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

本发明首先提供一种基于CRISPR/Cas9基因编辑系统特异性靶向敲除猪miR-155基因的优选sgRNA向导序列，即sgRNA39，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

本发明还提供了一种基于CRISPR/Cas9基因编辑系统特异性靶向敲除猪miR-155基因的细胞系，所述细胞系为猪肺泡巨噬细胞系。

本发明还提供一种基于CRISPR/Cas9基因编辑系统特异性靶向敲除猪miR-155基因的细胞系的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

（1）设计并合成猪miR-155基因特异性sgRNA向导序列，即sgRNA39，其序列如SEQID NO:1所示；

（2）构建miR-155基因敲除载体，pKLV2-U6-gRNA5(gGFP)-PGKBFP2AGFP-W-sgRNA39；

（3）将步骤（2）中所述的敲除载体与慢病毒包装质粒PSPXA2、PMD2.G，然后稳定转染HEK293T细胞，得到包装慢病毒，并将其浓缩；