[发明专利]短波处荧光内滤技术在检测半胱氨酸中的应用

说明书

本发明提供了一种短波处荧光内滤技术（SWIFT）在检测半胱氨酸中的应用，短波的激发波长为254 nm。在短波处，将罗丹明6G溶解于DMSO中得到罗丹明6G储备液，2‑甲酰基苯硼酸溶于乙腈溶液中得到2‑FPBA储备液，将罗丹明6G储备液和2‑FPBA储备液分别加入到PBS缓冲溶液中混合均匀，在混合液中加入半胱氨酸，在激发波长为254 nm下进行光谱测试。本发明以罗丹明6G作为荧光团，具有光稳定好，量子产率高，较宽的波长范围等优点，在微摩尔级的Cys的存在下，2FPBA可以与Cys很好的反应，本发明可以实时监测荧光团的稳定性以及可回收利用。这为检测Cys的存在提供了一种新的思路和方法。

技术领域

本发明涉及检测半胱氨酸的应用领域，具体涉及一种短波处荧光内滤技术在检测半胱氨酸中的应用。

背景技术

生物硫醇，如谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)，在许多生理和病理过程中发挥重要作用。例如，Cys在氨基酸运输、蛋白质合成、抗氧化损伤、提高胚胎发育速率等多种生理过程中发挥关键作用。谷胱甘肽是细胞中最丰富的硫醇，在细胞抵御毒素和自由基等生物过程中发挥着重要作用。在许多疾病中，Hcy作为生物标志物发挥着特殊的作用。一般来说，细胞内生物硫醇的水平与有毒物质和疾病有关。例如，Cys水平异常与生长迟缓、水肿、嗜睡、肝损伤等有关。血浆中Hcy升高是心血管疾病、阿尔茨海默病、骨质疏松症的危险因素，而GSH水平高则与白细胞减少、癌症、HIV感染等密切相关。因此，硫醇的检测对评估疾病发生发展水平非常重要。

许多技术被用于检测这些生物硫醇，如高效液相色谱(HPLC)、傅里叶变换红外(FTIR)光谱、质谱(MS)、电化学分析、紫外/可见光谱和荧光光谱。荧光传感因其简单、成本低、选择性和灵敏度高而受到广泛关注。因此，近年来许多荧光探针被应用于检测生物硫醇。大部分荧光探针是有共价连接的荧光基团和反应基团组成，生物硫醇与反应基团发生反应导致荧光基团的荧光强度的变化。然而，化学连接增加了探针的成本，并限制了探针的发展，使其只具有适合这种化学连接的化学基团。所以，本发明提供了一种荧光基团和分析物反应基团分离的设计方案，并应用于检测半胱氨酸。

发明内容

本发明提出了一种短波处荧光内滤技术（SWIFT）在检测半胱氨酸中的应用，主要采用商业荧光团罗丹明6G和简单的化合物2-FPBA组合检测半胱氨酸（Cys）。2-FPBA与Cys的巯基和氨基反应，引起在激发波长下（254 nm）的荧光内滤效应的减弱，从而使荧光团在激发波长下(254 nm)的荧光增强。

实现本发明的技术方案是：

短波处荧光内滤技术（SWIFT）在检测半胱氨酸中的应用，短波的激发波长为254nm。

在短波处，利用罗丹明6G和2-甲酰基苯硼酸检测半胱氨酸，其中商业荧光团罗丹明6G的结构式如下：

，简单的化合物2-FPBA（2-甲酰基苯硼酸）的结构式如下：。

将罗丹明6G溶解于DMSO中得到罗丹明6G储备液，2-甲酰基苯硼酸溶于乙腈溶液中得到2-FPBA储备液，将罗丹明6G储备液和2-FPBA储备液分别加入到PBS缓冲溶液中混合均匀，在混合液中加入半胱氨酸，在激发波长为254 nm下进行光谱测试。

所述罗丹明6G储备液的浓度为2 mM，2-FPBA储备液的浓度为40 mM，PBS缓冲溶液的浓度为10 mM、pH为7.4，分别向2 mL PBS溶液中加入罗丹明6G储备液2 μL和2-FPBA储备液5 μL作为检测体系。

分别测试检测体系加入Cys前后的紫外可见光谱和荧光光谱的变化，荧光的激发波长为254 nm；观察紫外及荧光图谱变化及其加入Cys前后荧光的变化。

荧光光谱的变化为：以254 nm光激发时，逐渐加入不同浓度的Cys后在564 nm处的荧光逐渐增强，并在某一浓度时达到最大值且保持不变。