[发明专利]由番茄红素基因介导的改造的克隆载体及其应用

权利要求书

1.一种可在酵母和大肠杆菌中复制的克隆载体，所述载体在现有质粒载体中插入可在酵母内表达的番茄红素基因作为颜色标记，其中所述的现有质粒载体选自下组：pCCI-Brick和pUC57-Brick。

2.根据权利要求1所述的克隆载体，其中所述番茄红素基因包含SEQ ID NO:1的序列或由SEQ ID NO:1的序列组成。

3.根据权利要求1或2所述的克隆载体，其中所述载体在番茄红素基因的两端各插入一个或多个只出现一次的酶切位点。

4.根据权利要求3所述的克隆载体，其中所述现有质粒载体为pCCI-Brick，且所述酶切位点选自：NheI、PacI、MauBI、MluI和PmeI，优选NheI和PacI。

5.根据权利要求3所述的克隆载体，其中所述现有质粒载体为pUC57-Brick，且所述酶切位点选自：SpeI、SmaI、PacI、PmeI、SalI、NotI、NheI、MauBI、MluI、PstI、FseI和SfiI，优选为SpeI和SmaI。

6.一种用权利要求1-5中任一项所述的克隆载体转化的酵母细胞。

7.一种制备可在酵母和大肠杆菌中复制的克隆载体的方法，其包括如下步骤：

(1)根据番茄红素基因的序列设计PCR扩增引物pf1和pr1，所述pf1包含番茄红素基因5’端同源区域和选自NheI或SpeI的酶切位点，且所述pr1包含番茄红素基因3’端同源区域和选自PacI或SmaI的酶切位点，以番茄红素基因为模板，以pf1和pr1为引物扩增适于组装所述克隆载体的番茄红素基因片段；

(2)根据现有质粒载体的序列设计PCR扩增引物pf2和pr2，以现有质粒载体为模板，以pf2和pr2为引物扩增适于组装所述克隆载体的现有质粒载体基因片段，其中所述现有质粒载体选自下组：pCCI-Brick和pUC57-Brick；

(3)将所述番茄红素基因片段与现有质粒载体基因片段以等摩尔量混合并在酵母细胞中组装以获得所述克隆载体。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述番茄红素基因包含SEQ ID NO:1的序列或由SEQ ID NO:1的序列组成。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述现有质粒载体为pCCI-Brick，所述pf1包含5’同源区域SEQ ID NO:2和酶切位点NheI，且所述pr1包含番茄红素基因3’同源区域SEQ IDNO:3和酶切位点PacI。

10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述现有质粒载体为pCCI-Brick，所述引物pf1和pr1分别为如SEQ ID NO:6所示的pCCI-f1和如SEQ ID NO:7所示的pCCI-r1。

11.根据权利要求7-10任一项所述的方法，其中步骤(2)中的现有质粒载体基因片段通过两部分分别扩增，其中用于扩增第一部分的引物pf2a和pr2a分别为如SEQ ID NO:8所示的pCCI-f2和如SEQ ID NO:9所示的pCCI-r2，且其中用于扩增第二部分的引物pf2b和pr2b分别为如SEQ ID NO:10所示的pCCI-f3和如SEQ ID NO:11所示的pCCI-r3。

12.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述现有质粒载体为pUC57-Brick，所述pf1包含5’同源区域SEQ ID NO:4和酶切位点SpeI，且所述pr1包含番茄红素基因3’同源区域SEQID NO:5和酶切位点SmaI。