[发明专利]不同功能特性的间充质干细胞在治疗不同疾病中的应用

说明书

本发明属于医疗诊断技术领域，尤其是涉及一种不同功能特性的间充质干细胞在治疗不同疾病中的应用。本发明首先一种单细胞转录组文库的制备方法，包括：采用自动化单细胞处理系统处理、金属浴中反应后进行PCR扩增、加入纯化磁珠后离心进行扩增后利用XNovaNGS测序平台进行测序，得到单细胞转录组文库等步骤。本发明提供了一种利用单细胞转录组测序技术诊断不同疾病的方法。利用单细胞转录组测序技术对同一来源的间充质干细胞的功能进行了鉴定并进行了亚群细分，初步建立了利用不同功能的间充质干细胞进行精准治疗的诊疗体系。

技术领域

本发明属于医疗诊断技术领域，尤其是涉及一种不同功能特性的间充质干细胞在治疗不同疾病中的应用。

技术背景

间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有自我更新和多向分化能力，如骨骼、软骨、脂肪、骨髓造血组织等。间充质干细胞可分泌许多抑制疾病发生的细胞因子，对抑制机体内的炎症反应，促进细胞再生具有积极作用。另外，间充质干细胞具有较低的免疫原性，在不同个体间差异较小，在进行异体移植时基本无不良反应，其安全性、可靠性已得到广泛地验证，因而被广泛地用于细胞治疗中。现有的证据也表明，间充质干细胞对于多种原发性疾病，如动脉粥样硬化、关节炎、多囊卵巢综合症等，均具有较好的诊疗效果。但干细胞治疗相关的基础研究较为薄弱，其深层次机制有待进一步探究。

单细胞转录组测序技术作为本世纪新兴的生物技术之一，在相当长一段时间里被认为是用于探索细胞间异质性的重要研究手段。单细胞测序技术的兴起也组学研究提供了全新的思路。由Tang等人开发的单细胞转录组测序技术在2009年问世，这种方法能够检测的基因数量远远超过了基因微阵列，可以更彻底地对发育阶段的转录表征进行检测。这些方法极大扩展了人类对生命活动的认知，加速了人类探索生命科学的进程。在随后的研究中，各种改进和创新的方法被陆续研发出来，包括Smart-seq2，MARS-seq，CEL-seq2，以及Drop-seq等。其中，根据建库方式的不同，我们可粗略地将这些方法归为两类，一类是全长转录组测序方法，另一类是基于独立分子标记(UMI)的测序方法，两类方法各有优劣。全长转录组测序的主要代表是Smart-seq以及Smart-seq2等，这类方法的优点是3’端偏好较低，测序深度较高。然而由于建库过程需要人为地将细胞分离至单独的管中，因而该类方法的建库过程繁琐且通量较低。而基于UMI的测序方法因其流程较前一种方法而言更为简化，因而可通过机器分选的方式进行单细胞建库。以Drop-seq为代表的UMI测序方法可在短时间内将数万个细胞分选为单个细胞的悬液，并将反转录的相关试剂共同包裹至单细胞液滴中，从而实现了快速且高通量的测序。

发明内容

尽管现有的研究已经证实间充质干细胞在治疗多种疾病中具有一定的疗效，但其具体的机制仍然不明。在进行干细胞治疗的过程中，发明人也发现，相同条件下制备的干细胞在不同人群间的疗效存在较大差异，而造成这种差异的原因仍不明了。发明人猜测相同来源的间充质干细胞的功能很可能存在差异，即使是同一来源的间充质干细胞，在不同培养条件下，其分泌的细胞因子、蛋白以及转录本等都可能存在差异。因此，本发明利用单细胞转录组测序技术对同一来源的间充质干细胞的功能进行了鉴定并进行了亚群细分，初步建立了利用不同功能的间充质干细胞进行精准治疗的诊疗体系。

技术方案要点如下：

1.利用单细胞转录组测序技术，对间充质干细胞进行转录组测序；

2.对单细胞转录组数据进行分析，根据不同基因功能对细胞进行分群；

3.通过挖掘不同亚群细胞的标记基因，筛选出特定功能的间充质干细胞，从而对不同人群进行精准治疗。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种单细胞转录组文库的制备方法，包括：

S1：制备得到单细胞悬液，所述单细胞悬液为间充质干细胞；

S2：将条形珠溶液离心后用缓冲液重悬后备用；