[发明专利]一种循环神经细胞检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种循环神经细胞检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：CTC富集的CD36抗体，2％FBS的HBSS缓冲液，密度梯度离心液，红细胞裂解液，细胞破膜封闭液，荧光标记的神经元特异性抗体，荧光标记的白细胞经典标志物抗体，细胞核荧光染料，微孔阵列芯片，包含循环神经细胞标志物的标准品和包含阳性对照和阴性对照的质控品。

2.如权利要求1所述的循环神经细胞检测试剂盒，其特征在于，所述荧光标记的神经元特异性抗体为荧光标记的神经元特异核蛋白抗体，又称为NeuN荧光标记抗体，所述荧光标记的白细胞经典标志物抗体为APC标记小鼠抗人CD45抗体，又称为CD45-APC抗体，所述细胞核染色剂为4',6-二脒基-2-苯基吲哚，Hoechst33342，Hoechst33258或Hoechst34580。

3.如权利要求1所述的循环神经细胞检测试剂盒，其特征在于，所述微孔阵列芯片用3％BSA封闭。

4.如权利要求1所述的循环神经细胞检测试剂盒，其特征在于，所述细胞破膜封闭液是含有0.3％Triton-100，5％羊血清(NGS)和0.05％吐温20(Tween-20)的磷酸盐缓冲液。

5.基于权利要求2所述的循环神经细胞检测试剂盒的密度梯度离心试剂盒，其特征在于，所述密度梯度离心试剂盒还包括密度梯度离心管和密度梯度离心液。

6.如权利要求5所述的密度梯度离心试剂盒的检测方法，其特征在于，检测步骤包括：

A1、将5毫升血液样本与25-125微升CTC富集的CD抗体室温孵育20分钟获得混合液L1；

A2、将15毫升含有2％FBS的HBSS缓冲液加入到混合液L1中充分混匀，得到混合液L2；

A3、将15毫升密度梯度离心液通过密度梯度离心管中间的小孔加入到密度梯度离心管的底部；

A4、混合液L2沿着密度梯度离心管的管壁转移到密度梯度离心管中；

A5、配平后，1200g离心20分钟，得到离心液L1；

A6、离心后，将上层的离心液L1转移到15毫升离心管中，再次配平后，600g离心8分钟，得到离心液L2；

A7、离心液L2弃上清后得到离心液L3，离心液L3中加入0.5毫升红细胞裂解液，室温孵育5分钟；

A8、300g离心5分钟，得到离心液L4，弃离心液L4的400微升上清后，得到混合液L3，将剩余100微升混合液L3重悬并转移到预先用3％BSA封闭的可寻址微孔阵列芯片中；

A9、在微孔阵列芯片上对细胞进行固定，破膜打孔封闭处理，4℃过夜孵育NeuN抗体，吸弃NeuN抗体并用PBS充分清洗，加入荧光标记二抗，CD45-APC抗体和DAPI充分混匀后加在微孔阵列芯片上并避光孵育2小时，PBS充分清洗；

A10、借助高内涵显微镜或激光共聚焦显微镜等显微成像系统对微孔阵列芯片进行扫描成像。

7.如权利要求6所述的密度梯度离心试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤A10中，检测结果为NeuN⁺/CD45^-/DAPI⁺的细胞为循环神经细胞。

8.基于权利要求2所述的循环神经细胞检测试剂盒的免疫磁珠试剂盒，其特征在于，所述免疫磁珠试剂盒还包括CD45修饰的免疫磁球。