[发明专利]一种血清中全谱维生素的检测方法

权利要求书

1.一种血清中全谱维生素的检测方法,其特征在于：先向血清样品加入同位素维生素作为内标；再通过固-液萃取法分别提取血清样本中的水溶性维生素和脂溶性维生素；使用T3色谱将维生素分离后，采用分段两次进样一次分析，内标矫正标曲进行串联质谱分析。

2.根据权利要求1所述的一种血清中全谱维生素的检测方法,其特征在于：具体包括以下步骤：

步骤S1、配制内标溶液；用水溶性维生素的同位素内标、0.3%甲酸水溶液和水制得IS-mixA混合内标溶液；用脂溶性维生素的同位素内标和纯甲醇制得IS-mixB混合内标溶液；

步骤S2、配制标准品溶液；用水溶性维生素标准品、0.3%甲酸水溶液和水制得mixA标准品溶液；用脂溶性维生素标准品和纯甲醇制得mixB标准品溶液；

步骤S3、构建标准曲线；使用人血清蛋白溶液将mixA标准品溶液分梯度稀释，得到若干浓度不同的mixA稀释溶液；使用人血清蛋白溶液将mixB标准品溶液分梯度稀释，得到若干浓度不同的mixB稀释溶液；将浓度相同的mixA稀释溶液和mixB稀释溶液混合，得到若干浓度不同的混合液；再对每份混合液做如下处理：加入IS-mixA混合内标溶液和IS-mixB混合内标溶液并涡旋混合；再加入甲醇/乙腈混合液并涡旋混合；待沉淀蛋白后再加入金标水并涡旋混合；用离心机离心后，取上清液过Ostro SPE板，收集过滤液于A离心管，得到滤液A1；再加入纯甲醇并涡旋混合，再过Ostro SPE板，收集过滤液于B离心管，并用异丙醇解吸附在Ostro SPE板上的脂溶性维生素，同样收集过滤液于B离心管，得到滤液B1；滤液A1使用真空干燥，再用0.3%甲酸水溶液复溶，再用离心机离心后取上清液，得到上清液A1；滤液B1使用氮气吹干，再用纯甲醇复溶，再用离心机离心后取上清液，得到上清液B1；对上清液A1、上清液B1进行分段两次进样一次LC-MS/MS分析，得到标准曲线；

步骤S4、样品分析；取血清样本，加入IS-mixA混合内标溶液和IS-mixB混合内标溶液并涡旋混合；再加甲醇/乙腈混合液并涡旋混合，待沉淀蛋白后再加入金标水并涡旋混合；再用离心机离心后，取上清液过Ostro SPE板，收集过滤液于A离心管，得到滤液A2；再加入纯甲醇并涡旋混合；过Ostro SPE板，收集过滤液于B离心管，加入异丙醇解吸附Ostro SPE板上的脂溶性维生素，同样收集过滤液于B离心管，得到滤液B2；滤液A2使用真空干燥，再用0.3%甲酸水溶液复溶，用离心机离心后取上清液，得到上清液A2；滤液B2使用氮气吹干，再用纯甲醇复溶，用离心机离心后取上清液，得到上清液B2；对上清液A2和上清液B2进行分段两次进样一次LC-MS/MS分析；将分析结果使用步骤S3构建的标准曲线换算出对应维生素浓度。

3.根据权利要求1所述的一种血清中全谱维生素的检测方法,其特征在于，所述步骤S1具体是：称取水溶性维生素的同位素内标，向其中加入0.3%甲酸水溶液溶解制成10μg/ml的溶液，再取40μL该溶液用水稀释定容至1ml，制得浓度为400ng/ml的所述IS-mixA混合内标溶液；称取脂溶性维生素的同位素内标，向其中加入纯甲醇溶解制成10μg/ml的溶液，再取40μL该溶液用纯甲醇稀释定容至1ml，制得浓度为400ng/ml的所述IS-mixB混合内标溶液。

4.根据权利要求1所述的一种血清中全谱维生素的检测方法,其特征在于，所述步骤S2具体是：称取水溶性维生素标准品，向其中加入0.3%甲酸水溶液溶解制成1mg/ml的水溶性维生素标准品母液，再取40μL该母液用水稀释定容至1ml，制得浓度为25μg/ml的所述mixA标准品溶液；称取脂溶性维生素标准品，向其中加入纯甲醇溶解制成1mg/ml的脂溶性维生素标准品母液，再取40μL该母液用纯甲醇稀释定容至1ml，制得浓度为25μg/ml的所述mixB标准品溶液。

5.根据权利要求1-3任一所述的一种血清中全谱维生素的检测方法,其特征在于：所述步骤S1中，水溶性维生素的同位素内标包括Nicotinamide-13C6、Pyrioxine-d3和Folicacid-13C5。