[发明专利]一种珠星三块鱼特异性DNA分子标记及其应用

说明书

本发明提供了一种珠星三块鱼特异性DNA分子标记、DNA条形码及珠星三块鱼种质快速鉴定和提纯的方法。针对目前已经出现的珠星三块鱼种质混杂问题，本发明通过表型筛选、DNA条形码筛选及珠星三块鱼特异性DNA分子标记筛选鉴定，最终筛选出稳定的珠星三块鱼种质资源。本发明所述的珠星三块鱼种质快速提纯的方法操作简单、准确性高、周期短、稳定性好、且种质纯度高，为种质保护、合理利用及种质生物多样性提供了技术支持。

技术领域

本发明涉及一种鱼类种质提纯方法，具体涉及一种珠星三块鱼特异性DNA分子标记及其品种鉴定和种质快速提纯的方法。

背景技术

三块鱼(Tribolodon)是鲤形目、鲤科、雅罗鱼亚科三块鱼属几种土著经济种的统称，主要分布于太平洋西北部的日本海及一些内陆淡水河流，是唯一降海洄游的鲤科鱼类。在我国仅分布于绥芬河和图们江流域。三块鱼是传统的名贵珍稀鱼类，肉质细嫩、肉味鲜美，肉中蛋氨酸和赖氨酸等人体必需氨基酸含量比一般鱼类高，含有丰富的不饱和脂肪酸和维生素A、维生素D等。研究证明，三块鱼体内含有一种多糖黏蛋白质，有促进细胞发育、提高机体免疫力、降低胆固醇、防止动脉硬化和冠心病的功能，对代谢性疾病、身体虚弱等也有较好疗效。历史上，三块鱼与兴凯湖的大白鱼和乌苏里江的鲑鱼并称为“边塞三珍”。

近年来，由于水域环境遭到破坏，加之污染和酷捕滥捞等多种自然和人为因素，三块鱼资源濒临枯竭。为了增加三块鱼的野生种群数量，我国东宁县鲑鱼孵化放流站(绥芬河)从1989年开始每年通过捕捞洄游产卵群体，通过人工繁殖、放流，补充三块鱼野生资源。三块鱼每年4-6月份由日本海分批溯河到我国绥芬河产卵，当地渔民根据洄游群体的婚姻色和洄游时间将其分为“金滩头”、“银滩头”和“黑滩头”3种。但是解剖学、同工酶、线粒体DNA和核DNA分子标记等越来越多的证据证实溯河到我国绥芬河产卵的三块鱼只有2种，分别为俗称金滩头的珠星三块鱼(T.hakonensis)和俗称黑滩头的三块鱼(T.brandtii)。

珠星三块鱼和三块鱼两种鱼类形态相似，只有性成熟(4龄可达到性成熟)洄游产卵时其婚姻色，即体侧“红线”的分布和数量存在明显差异，因此可依据婚姻色进行分类判定。珠星三块鱼体侧表现为3条红线，而三块鱼在侧线下鳞靠近腹部有1条红线，还有很多个体的“红线”表型特征介于“二者”之间或不具备“红线”特征，不易判别。利用表型鉴定和分子标记检测发现，珠星三块鱼种质混杂严重，一些个体表型和基因组都出现了三块鱼特有的表型特征和基因痕迹。早期，日本学者Miura Masao和OkataAhihiro对珠星三块鱼和三块鱼两个物种早期发育进行了系统的形态学研究，利用载黑素细胞在体节不同位置区分这两个物种鱼苗(Masao and Ahihiro.1995.A study on morphological disrimationbetween Triobolodonbrandtii and T.hakonensis at the early developmentstages.45:103-109.)。但此方法在实践操作中不易掌握，需要对相同发育时间上的不同种幼鱼进行细致的观察比较，筛选周期也较长。专利CN107365872B提供了一种利用微卫星引物SSR-1和SSR-2鉴定绥芬河三块鱼不同洄游群体的方法，可区分珠星三块鱼、三块鱼或二者的杂交。专利CN109439762A则提供了一种更为简化的分子标记引物对A8和A11，用于鉴定珠星雅罗鱼(珠星三块鱼)和三块鱼。

DNA序列辅助分类作为一个理想的辅助形态学分类手段，迄今已有30多年历史。2003年，Herbert首次提出DNA条形码(DNA barcoding)定义，即通过使用短的、标准化的基因片段来进行物种鉴定，以提高真核生物识别的效率，同时使得DNA序列辅助分类方法得到一定程度的统一，加快发展进程。目前，DNA条形码技术已经成为一个被广泛接受的物种鉴定工具，它重点强调了标准化和数据验证，亦被称为DNA分类学。目前，线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因是动物DNA条形码研究中使用最为广泛的标准基因，因为它具有：(1)适中的序列变异程度；(2)变异区域两端的序列高度保守；(3)序列长度适宜等特点。这一结论在许多鱼类、昆虫和鸟类等动物中均得到很好验证，但对于珠星三块鱼的研究尚未空白。