[发明专利]一种稳定多肽及其制备方法

说明书

本发明一种稳定多肽，其结构式如下所示：X代表任意氨基酸，M代表甲硫氨酸氨基酸；linker代表连接子，M的位置在多肽的首端、末端或者多肽的任意两个氨基酸之间。本发明还提供了上述的一种稳定多肽的制备方法，在所述的多肽的首端、末端或者多肽的氨基酸之间设置一个甲硫氨酸氨基酸。本发明采用在酸性条件下，通过4‑溴巴豆酸，2‑溴乙酸，3‑溴丙酸，4‑溴丁酸，5‑溴戊酸等一系列烷基化试剂，通过烷基化及化学选择性，选择含有一个甲硫氨酸残基的天然的线性多肽，通过末端关环的方式从而构建稳定多肽。本发明构建的稳定环肽的细胞膜穿透性和稳定性较其线性天然的线性多肽有显著性的提高。

技术领域

本发明属于生物化学领域，涉及一种多肽的制备方法，具体来说是一种稳定多肽及其制备方法。

背景技术

蛋白的结构和功能的多样性使其成为大自然中功能最丰富、最具吸引力的一类分子。人类基因组计划揭示了大约有20000至25000个基因参与蛋白质的编码，但是这些基因编码的蛋白质远远不能满足蛋白作为生命活动的主要承担者的复杂性。蛋白质翻译后修饰，在不改变基因序列的前提下，对蛋白质进行再修饰，赋予蛋白新的结构和功能，促使蛋白能精准的调控整个生命活动。常见的蛋白翻译后修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化、羟基化、糖基化、脂化等等，不同位点或者不同种类的蛋白修饰对蛋白的结构或功能产生重要影响。

21世纪以来，不断发展和完善的稳定多肽技术在锁定多肽活性构象的同时，多肽作为对靶点具有较高选择性和亲和性的配体，近几年也被用于介导蛋白选择性的共价修饰。香港中文大学的夏江教授在该领域做了优秀的工作，他们利用α-氯乙酰胺在多肽配体的介导下与PDZ^ΔRGS3的空间位点靠近的Cys发生共价反应，在细胞内可实现高选择性的蛋白共价修饰。2016年，哈弗大学的Walensky教授和澳大利亚昆士兰大学的Fairlie教授分别在BIM蛋白的BH3螺旋上引入全碳氢侧链的方法稳定多肽螺旋结构，同时在多肽N端引入丙烯酰胺基团，该多肽抑制剂在与BFL-1蛋白结合时，多肽上的丙烯酰胺在空间诱导下实现与BFL-1蛋白的Cys共价反应，形成稳定多肽的共价抑制剂，提高了多肽抑制剂的抗肿瘤效果。同年，加州大学旧金山分校的王磊教授用全碳氢侧链稳定P53多肽螺旋的同时，在多肽的侧链引入磺酰氟化合物，该多肽与MDM4相互结合时，多肽侧链上的磺酰氟基团与蛋白上的赖氨酸空间靠近，从而触发共价反应，形成蛋白-多肽共价体。

基于多肽配体诱导的蛋白共价修饰需要在稳定多肽二级结构的同时在侧链上额外引入与蛋白Cys反应的基团，合成步骤更繁琐，而且引入的化学基团有可能出现非特异性结合的问题。然而，以上稳定多肽技术，都不可避免的在多肽分子本身额外的引入了一个有可能与靶点有潜在有利/不利相互作用的侧链。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种稳定多肽及其制备方法，所述的这种稳定多肽及其制备方法要解决现有技术中制备稳定多肽的合成步骤繁琐，而且引入的化学基团有可能出现非特异性结合的技术问题。

本发明提供了一种稳定多肽，其结构式如下所示：

X代表任意氨基酸，M代表甲硫氨酸氨基酸；linker代表连接子，M的位置在多肽的首端、末端或者多肽的任意两个氨基酸之间。

进一步的，甲硫氨酸氨基酸与连接子之间具有三个氨基酸。

本发明还提供了上述的一种稳定多肽的制备方法，在一个多肽的首端、末端或者多肽的氨基酸之间设置一个甲硫氨酸氨基酸。

本发明通过液相，质谱，核磁共振技术等，证实了化学选择性的烷基化多肽甲硫氨酸—该方法的可行性和普适性。

本发明提供了上述的多肽在体外条件下的可还原性。

本发明通过连接荧光素多肽的流式细胞分析和激光共聚焦实验，证实该关环多肽显著的提高了其线性多肽的穿膜性。