[发明专利]一株贝莱斯芽孢杆菌Z002、获取方法及其应用

权利要求书

1.一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Z002，已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC No：M 2020567。

2.一种如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌Z002的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，分离，包括：

(1)取经检验表面灭菌彻底的烟株组织0.4～0.6g，与灭菌钢珠一并放入2mL灭菌离心管中，加入400～700μL无菌水，用组织研磨器研磨2～4min，频率为20～40r/s；

(2)梯度稀释研磨后的组织液至10^-4，每梯度各取100～300μL匀浆液涂分离培养基，每处理重复4次；

(3)经黑暗培养后，根据菌落形态、颜色的不同挑取单菌落，重新于分离培养基上划线纯化，挑取划线培养的单菌落移入分离培养基试管斜面保存；

第二步，筛选，包括：

(1)采用平板对峙法，用直径0.5～0.8cm的打孔器将烟草霉变病菌米根霉菌丝块贴接于筛选培养基平皿中心，两侧对称划线接种内生细菌，以只接烟草霉变病菌米根霉菌丝块的处理为对照；

(2)恒温培养，待对照长满全皿时，检查对峙培养结果，记录抑菌带的宽度，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象来判断分离的内生细菌对病原菌有无拮抗作用，每个处理3次重复；

第三步，纯化，包括：

将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，即贝莱斯芽孢杆菌Z002。

3.如权利要求2所述的获取方法，其特征在于，在第一步分离中：

所述培养条件为：25～30℃，时间40～55h；

所述分离培养基成分以g/L计为：蛋白胨3.0～7.0、牛肉膏2～4.0、氯化钠6.0～10.0及琼脂15～18；其pH为6.8～7.5。

4.如权利要求2所述的获取方法，其特征在于，在第二步筛选中：

所述培养条件为：26～30℃，时间48～60h；

所述筛选培养基成分以g/L计为：马铃薯180～220、葡萄糖18～25及琼脂15～18，加蒸馏水至1000mL；其pH为6.8～7.4。

5.如权利要求2所述的获取方法，其特征在于，在第三步纯化中：

所述培养条件为：25～30℃，时间40～55h；

所述纯化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0及琼脂15.0～19.0；其pH为7.0～7.5。

6.如权利要求2至5任一项所述的获取方法，其特征在于：

在第一步中，所述的烟株组织为烤烟“红花大金元”的叶片和/或茎。

7.一种如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在烟草霉变病防治中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

步骤a，发酵，包括：

(1)将贝莱斯芽孢杆菌Z002接种到斜面培养基上，得到发酵种子；

(2)将发酵种子接种到种子培养液中，接种量为3～5v/v％，摇瓶装液量为25～35v/v％，得到发酵菌剂；

步骤b，接种：在烟叶编制成杆前或编制后，将发酵菌剂稀释1～4倍，按照每杆烟50～200mL喷施烟叶叶柄伤口处；

步骤c，调制：喷施过发酵菌剂的烟叶按正常调制程序烘烤7～11d，即可实现烤房烟草霉变病的有效防控。

8.如权利要求7所述的贝莱斯芽孢杆菌在烟草霉变病防治中的应用，其特征在于，在步骤a发酵中，所述将贝莱斯芽孢杆菌Z002接种到斜面培养基上还包括：

所述的斜面培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0及琼脂15.0～19.0；其pH为7.0～7.5；

其培养条件为25～30℃，时间48～72h。