[发明专利]新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法

说明书

本发明公开了新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，具体包括如下步骤：载体构建，DH10Bac感受态细胞制备，转座以及杆粒的抽提与验证。该新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，通过构建RBD重组质粒时，未加任何标签，因此后期蛋白表达时不会有任何氨基酸残留，从而减少了其他氨基酸残基对后期该蛋白的研究造成的干扰，使用昆虫HF细胞代替昆虫SF9细胞，可以在一定程度上增加了该蛋白的分泌表达质量，在最终放大过程中，48h后立即收集细胞上清进行纯化，缩短了收样时间，纯化时在上清中添加蛋白酶抑制剂且全程低温操作，大大减少了该蛋白的降解可能性，使用Biacore检测目的蛋白活性，确保了目的蛋白活性。

技术领域

本发明涉及重组RBD蛋白生产技术领域，具体为新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法。

背景技术

2019新型冠状病毒，2020年1月12日，世界卫生组织正式将其命名为2019-nCoV。冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征和严重急性呼吸综合征等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。中东呼吸综合征冠状病毒是2012年出现的新型冠状病毒，该病毒能够引发严重的人类呼吸系统的疾病，其致死率高达36％，目前还没有针对该病毒特异性治疗的药物和手段。MERS-CoV通过表面刺突蛋白识别并结合受体DPP4，其表面刺突蛋白N端S1亚基上的受体识别结合域主要负责与受体的结合。

利用昆虫细胞表达2019-nCoV的棘突蛋白受体结合结构域的重组杆状病毒2019-nCoV RBD，为2019-nCoV免疫抗体的制备和体外检测及后续疫苗的研究开发奠定了基础，本发明提供了新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，解决了重组RBD蛋白在昆虫细胞中进行生产的过程中其他氨基酸残基对后期该蛋白的研究造成干扰以及蛋白的降解程度和蛋白的活性问题。

发明内容

(一解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，解决了重组RBD蛋白在昆虫细胞中进行生产的过程中其他氨基酸残基对后期该蛋白的研究造成干扰以及蛋白的降解程度和蛋白的活性问题。

(二技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：新冠重组RBD蛋白在昆虫细胞中的生产方法，具体包括如下步骤：

步骤一、载体构建：密码子优化后通过基因合成技术将重组RBD基因亚克隆克隆到pFastbac1中；

步骤二、DH10Bac感受态细胞制备：取DH10Bac菌株，对DH10Bac菌株平板划线至双抗LB平板中，双抗LB平板中含有浓度为50μg/mg K和10μg/mg T；

步骤三、转座：准备含三抗显色LB平板，其中三抗显色LB平板中含有50μg/mgkanamycin sulfate、10μg/mg tetracycline hydrochloride、7μg/mg gentamicinsulphate、40μg/mg IPTG与100μg/mg X-Gal，将三抗显色LB平板转座至DH10Bac感受态中，进行蓝白斑筛选，PCR技术筛选出阳性单克隆菌落后制备Bacmid质粒；

步骤四、杆粒的抽提与验证：在无菌的24孔摇菌板中加入4mL三抗LB培养基，在培养后的三抗显色板中挑取白色单克隆菌落数个分别放入摇菌板中，在温度为37℃转速为220rpm的条件下培养过夜，拿出摇菌板，取2mL的培养物分别加至2.0mL离心管中，向离心管中加入50μL无菌ddH₂O，充分溶解沉淀，即为昆虫杆状病毒质粒溶液，简称杆粒，得到新冠重组RBD蛋白。

优选的，所述RBD基因表达的序列：