[发明专利]一种大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin重组蛋白及其应用

说明书

本发明提供一种大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin重组蛋白及其应用，属于基因工程技术领域。本发明构建了高效表达大黄鱼Cystatin重组蛋白的毕赤酵母工程菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020369。利用毕赤酵母工程菌生产的大黄鱼Cystatin重组蛋白，可抑制木瓜蛋白酶、大黄鱼组织蛋白酶B和S的活性，上调巨噬细胞内炎症相关因子TNFα的表达水平，并诱导巨噬细胞中抗菌活性物质一氧化氮产生，表明大黄鱼Cystatin重组蛋白作为蛋白酶抑制剂和免疫增强剂具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin重组蛋白及其应用。

背景技术

半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Cystatins）是一类与半胱氨酸蛋白酶紧密结合、可逆的天然抑制剂。它们能够调节半胱氨酸蛋白酶的功能，保护机体免受来自于自身、细菌或病毒的蛋白酶的破坏性水解，在维持机体内环境稳态、抗细菌和病毒感染以及调节炎症反应中发挥重要作用 (Natasˇa Kopitar-Jerala. 2006. The role of cystatins in cells ofthe immune system. FEBS Letters 580: 6295–6301)。根据定位、大小和多肽链复杂程度不同，半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员分为3种类型：第一个类型是stefins，包括Cystatin A和B，由约98个氨基酸组成，没有二硫键和糖基化，主要分布于细胞内；第二个类型是Cystatin，包括Cystatin C、D、E、F等，由约120个氨基酸组成，含有两个链内二硫键，具有胞外定位的信号肽；第三类是kininogens，主要存在于血浆和哺乳动物的分泌物中，包含3个Cystatin结构域（Josiah Ochieng, Gautam Chaudhuri. 2010. Cystatinsuperfamily. J Health Care Poor Underserved. 21: 51-70）。目前，多种Cystatin基因已经在鱼类中报道，但是其应用性研究仍比较欠缺。

发明内容

本发明在于提供一种大黄鱼半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin重组蛋白及其应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种生产的大黄鱼Cystatin重组蛋白的毕赤酵母工程菌，所述工程菌为毕赤酵母（Pichia pastoris）SMD1168/pPICZαA-Cystatin，于2020年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020369，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

上述工程菌的制备方法为：将如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列克隆到表达载体pPICZαA，电转毕赤酵母后得到工程菌。

利用上述工程菌表达大黄鱼Cystatin重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

进一步地，将上述大黄鱼Cystatin重组蛋白应用于制备蛋白酶抑制剂或者免疫增强剂，所述蛋白酶抑制剂用于抑制木瓜蛋白酶或大黄鱼组织蛋白酶B和S的活性；所述免疫增强剂用于上调巨噬细胞内炎症相关因子TNFα的表达水平，并诱导巨噬细胞中抗菌活性物质一氧化氮的产生。

本发明的优点在于：利用本发明毕赤酵母（Pichia pastoris）SMD1168/pPICZαA-Cystatin表达的大黄鱼Cystatin重组蛋白不仅能够抑制多种蛋白酶的活性，而且增强巨噬细胞抗菌功能。

附图说明

图1为本发明实施例提供的大黄鱼Cystatin重组蛋白电泳图。A，M为蛋白分子量标准；泳道1为含有pPICZαA载体的毕赤酵母工程菌培养液上清；泳道2为毕赤酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-Cystatin培养液上清。B，M为蛋白分子量标准；泳道1为纯化的大黄鱼Cystatin重组蛋白。