[发明专利]一种重组犬长效干扰素α的制备方法

权利要求书

1.一种重组犬长效干扰素α的制备方法，其特征在于包括如下步骤：通过将犬长效干扰素α和标签蛋白类弹性蛋白多肽ELP进行融合表达制得重组犬长效干扰素α，在保留干扰素活性的情况下，延长它的半衰期，增加其稳定性。

2.根据权利要求1所述的重组犬长效干扰素α的制备方法，其特征在于：所述的类弹性蛋白多肽ELP为一类具有可逆相变特性的融合标签，所述的类弹性蛋白多肽ELP为五肽聚合物，所述的五肽聚合物分别由50-90个重复的VPGXG(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)组成，其中Xaa为客座氨基酸。

3.根据权利要求1所述的重组犬长效干扰素α的制备方法，其特征在于:所述的客座氨基酸为脯氨酸以外的任何氨基酸。

4.根据权利要求3所述的重组犬长效干扰素α的制备方法，其特征在于：所述的客座氨基酸为组氨酸。

5.根据权利要求1至4任一项所述的重组犬长效干扰素α的制备方法，其特征在于：

(1)人工合成重组犬干扰素α目的基因；

(2)构建犬长效干扰素α重组载体，获得基因工程表达质粒；

构建犬长效干扰素α重组载体，获得基因工程菌；

(3)将构建的重组犬长效干扰素α质粒转化到大肠杆菌宿主细胞，获得基因工程菌，进行重组蛋白诱导表达，制得重组犬长效干扰素α；

(4)对重组犬长效干扰素α进行纯化和检测。

6.根据权利要求5所述的重组犬长效干扰素α的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述的基因工程菌为pET28a-ELP80-CaIFNα，构建重组目的基因ELP80-CaIFNα至pET28a载体上；

所述的表达载体为重组犬长效干扰素α表达质粒。

7.根据权利要求5所述的重组犬长效干扰素α的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，扩增重组目的基因：设计引物，通过PCR或者人工合成得到重组犬干扰素α目的基因；

在步骤(2)中，将重组目的基因连接到pET28az质粒上获得重组载体；将表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中进行表达，制得含有重组犬长效干扰素α表达质粒pET28a-ELP80-CaIFNα的基因工程菌。

8.根据权利要求5所述的重组犬长效干扰素α的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的目的基因扩增引物为上游引物ELP80-F和下游引物ELP80-R，所述上游引物ELP80-F具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述的下游引物ELP80-R具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

在步骤(3)中，将构建的pET28a-ELP80-CaIFNα阳性质粒转入表达菌株E.coilBL21(DE3)中进行表达，在37℃经IPTG诱导表达后，超声破碎、离心收集上清与沉淀，通过SDS-PAGE验证目的蛋白表达。

9.根据权利要求5所述的重组犬长效干扰素α的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，根据犬干扰素α序列，选取pET28a空载体，根据空载体中的多克隆位点序列，利用SnapGene软件设计引物及目的蛋白的序列ELP80H-CaIFNα，根据所使用载体骨架的酶切位点序列，各自引入合适的酶切位点。将目的基因和pET28a载体连接后，转化至DH5α感受态中，获得含有pET28a-ELP80-CaIFNα的基因工程菌；

在步骤(3)中，将构建的pET28a-ELP80-CaIFNα阳性质粒转入表达菌株E.coil BL21(DE3)中进行表达，在15℃经1mM IPTG诱导表达24h后，超声破碎、离心收集上清与沉淀，通过SDS-PAGE验证目的蛋白表达；

在步骤(4)中，获得表达的重组蛋白ELP80-CaIFNα以可溶性形式存在于上清中，通过优化蛋白的相变温度及纯化条件后再经过ITC纯化。

10.根据权利要求5所述的重组犬长效干扰素α的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述为BL21(DE3)为感受态细胞；在步骤(3)中，所述的融合蛋白的纯化方法：可逆相变循环(ITC)进行蛋白质分离纯化；收集ELP80-CaIFNα表达菌破碎上清，取1mL上清中加入0.5mL浓度为2M的NaCl，在37℃孵育20min后离心，收集沉淀加入0.5mL预冷的缓冲液重悬，4℃下孵育20min后离心，收集上清；37℃孵育-离心-4℃孵育-离心-重悬的过程被看作是一轮ITC，进行2轮ITC纯化后获得ELP80-CaIFNα纯度在95％以上。