[发明专利]一种检测中华鳖黄病毒的特异性引物、探针及试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测中华鳖黄病毒的特异性引物、探针及试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明通过收集病鳖组织样本，进行病原分析，证明引发该病的病原为一种病毒。采用RACE技术获得病毒的部分序列后，针对性的设计了特异性检测该病毒的引物组、探针及试剂盒，提供了灵敏、特异、快速检测中华鳖黄病毒的方法，填补了目前尚无中华鳖黄病毒检测方法的空白，适合中华鳖黄病毒病的确诊、筛查和预防。本发明将为苗种检疫提供技术支撑，为从源头上切断病毒传播提供工具，有利于中华鳖养殖产业的绿色可持续发展。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种检测中华鳖黄病毒的特异性引物、探针及试剂盒。

背景技术

中华鳖(Pelodiscus sinensis)俗称甲鱼、团鱼及王八等，隶属于龟鳖目(Testudines)，野生中华鳖在中国境内广泛分布。中华鳖营养价值高，又可入药，深受广大消费者喜爱，一直都是我国重要的水产养殖经济动物。近几年在浙江省一些中华鳖养殖场中出现爆发性死亡病例，主要发病特点为：一是食量下降，早期个别病鳖漂浮在水面，或趴在岸边，表现出游动无力、厌食的症状；二是有出血情况，患病未死亡或刚死不久的甲鱼，外观腹部肿胀，有的呈现底板发红，解剖发现腹腔内有大量腹水，肠道不平滑、有打结情况，部分患病未死亡的甲鱼，用手一抓鳖血从口鼻处流出；三是死亡率高，一旦池塘发现有病鳖，传染性极强，3-5天内就会蔓延，死亡率高达90％以上，甚至还会传染给周边池塘；四是潜伏期长，有的中华鳖养殖3-4年，未见发病，但当养殖环境改变，则开始出大批量死亡。关于该种疾病的致病原因以及检测方法至今未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测中华鳖黄病毒的特异性引物、探针及试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题，本发明在检测中华鳖黄病毒中具有灵敏、特异、快速等特点，填补了目前尚无中华鳖黄病毒检测方法的空白，适合中华鳖黄病毒病的确诊、筛查和预防。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种中华鳖黄病毒，所述的中华鳖黄病毒部分基因序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供一种检测所述的中华鳖黄病毒的特异性引物组，所述特异性引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的TSFV-F1和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的TSFV-R1。

本发明还提供一种与所述检测中华鳖黄病毒配合使用的探针，所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供一种标准质粒，所述的质粒中如含有SEQ ID NO.7所示的中华鳖黄病毒标准品序列。

本发明还提供所述的标准质粒的制备方法，包括以下步骤：对SEQ ID NO.7所示的中华鳖黄病毒标准品序列进行PCR扩增，利用特异性引物P1/P2扩增1500bp的靶序列，采用基因克隆技术，将靶序列与T载体进行连接，构建含有1500bp特异性序列的阳性重组质粒；所述的特异性引物P1序列如SEQ ID NO.2所示，特异性引物P2序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供一种检测中华鳖黄病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括所述的特异性引物组、所述的探针和所述的标准质粒。

优选的，所述试剂盒中还包括4×TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix和DEPC水。

优选的，所述特异性引物组浓度为18μM，探针的浓度为5μM。

本发明还提供一种利用所述的试剂盒检测中华鳖黄病毒的检测方法，包括如下步骤：利用所述的引物组与探针进行荧光定量PCR扩增待测样品，设DEPC水为阴性对照，标准质粒为阳性对照，荧光信号设定为FAM荧光素，每个循环结束收集荧光信号；