[发明专利]一种用于检测艰难梭菌的核酸适配体及应用

说明书

本发明公开了一种用于检测艰难梭菌的核酸适配体及应用，属于分析检测领域。一种通过体外筛选获得的适配体检测艰难梭菌的方法，能够特异性识别艰难梭菌毒素B蛋白降解片段。本发明还公开了一种利用上述适配体构建纸基分析器件的方法，用疏水蜡打印图案纸构建工作区域，在工作区域内以3D DNA适配体作为识别元件，通过其与蛋白降解片段特异性结合释放探针，引发滚环扩增反应，产物使底物颜色发生变化。颜色信号与蛋白降解片段浓度之间存在线性关系，从而实现对毒素B的定量检测。此方法灵敏度高，特异性好，可以对艰难梭菌毒素B进行有效测量，检出限为60pM，检测效果优于现有酶联免疫法检测试剂盒(150pM)，达到了快速检测的要求。

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种用于检测艰难梭菌(Clostridiumdifficile)的核酸适配体及应用。

背景技术

核酸适配体(Aptamers)是一种通过体外筛选技术(SELEX)从随机序列文库中获得的具有特异性识别和结合功能的核酸片段。由于具有化学稳定性高、亲和力高和生产成本低等特点，适配体已成为当前生物分析检测和生物医学研究中重要的智能生物识别工具。适配体可结合的靶标分子范围广泛，包括小分子、蛋白质和细胞等。

体外筛选中往往使用具有天然稳定构象的高纯度蛋白质作为靶标分子来获得可特异性结合蛋白质的适配体。而在临床诊断领域，临床样品(血液、尿液或粪便)中的蛋白质生物标志物由于受到水解、氧化和pH变化等影响可能发生降解，因此使用常规方法得到的适配体在实际样品中的特异性识别能力会大大降低，这极大限制了适配体在临床诊断方面的应用。

艰难梭菌是一种具有产毒素能力的芽孢杆菌，是引起抗生素相关性腹泻的主要原因，其生物标志物为毒素B(TcdB)。当毒素B排出体外后，由于生理条件的改变，会自发降解成小蛋白质片段或肽段，使现有的以天然稳定构象蛋白为检测目标的方法难以发挥作用，给临床诊断艰难梭菌感染带来了巨大的挑战。因此，通过体外筛选获得特异性识别毒素B降解片段的适配体，建立准确、快速的诊断方法对于控制艰难梭菌感染至关重要。

发明内容

本发明为了解决现有的技术问题，利用体外筛选技术获得对蛋白降解片段具有特异性识别能力的核酸适配体，并提供一种利用识别蛋白降解片段的核酸适配体检测艰难梭菌的方法。该核酸适配体可以识别人体粪便样本中的降解毒素B和天然毒素B。利用上述核酸适配体制作一种简单的纸基分析器件，通过比色法检测粪便样本中的毒素B和艰难梭菌菌株。将具有特异性识别蛋白降解片段的核酸适配体与纸基传感器件相结合，可扩大核酸适配体在临床诊断中的实用价值。

本发明为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于检测艰难梭菌的核酸适配体，包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种用于检测艰难梭菌的核酸适配体，包括如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。

进一步地，上述技术方案中，所述核酸适配体的二级结构包含一个稳定的茎S1和位于两个单链区J1/2一侧的弱稳定茎环结构S2-L1。

进一步地，上述技术方案中，所述核酸适配体的二级结构包含位于两个单链区J1/2一侧的弱稳定茎环结构S2-L1。

进一步地，上述技术方案中，所述核酸适配体可以特异性识别艰难梭菌毒素B、毒素B降解片段或肽段以及经热处理后的毒素B。

进一步地，上述技术方案中，所述毒素B蛋白降解片段或肽段的大小为50kDa。

进一步地，上述技术方案中，所述热处理后的毒素B为90℃加热15min后的毒素B。