[发明专利]一株耐乙酸和糠醛的发酵菌株及其构建方法

说明书

本发明提供了一株耐乙酸和糠醛的发酵菌株及其构建方法，该酿酒酵母菌株为SEB16，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏编号为CGMCC No.19589。本发明利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术，以可高效利用木糖的菌株SEB5为出发菌株，将编码目标转录因子的基因(HAA1和TYE7)和功能基因(FDH1)的启动子替换为在各典型抑制物胁迫下表达量较高且稳定的UBI4的启动子，将基因HAA1、TYE7和FDH1同时过表达获得菌株SEB16。该菌株SEB16耐受乙酸和糠醛能力较强，乙醇收率达到理论收率的85％，对于利用木质纤维素类原料生产燃料乙醇具有重要意义。

技术领域

本发明涉及发酵菌株的构建技术领域，尤其涉及一株耐乙酸和糠醛的发酵菌株及其构建方法。

背景技术

以农业秸秆为原料生产燃料乙醇是秸秆资源化利用途径之一。在秸秆预处理和糖化过程中，纤维素和半纤维素被水解为以葡萄糖和木糖为主的单糖，同时会产生弱酸类、呋喃类和酚类多种副产物，这些副产物会抑制产乙醇微生物酿酒酵母的生长和发酵。因此，培育能耐受各类抑制物的可高效发酵葡萄糖和木糖产乙醇的酿酒酵母菌株，是实现秸秆燃料乙醇工业化生产的基础。

乙酸和糠醛分别作为弱酸类和呋喃类抑制物的典型代表，广泛存在于不同来源的木质纤维素类水解液中。乙酸主要由木质纤维素预处理过程中木糖脱乙酰作用生成，糠醛则主要伴随半纤维素的解聚及木糖的形成而产生。鉴于乙酸和糠醛的普遍存在性及较高的胁迫浓度，构建耐受混合抑制物的酿酒酵母菌株对于利用木质纤维素类原料生产燃料乙醇具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一株耐乙酸和糠醛的发酵菌株及其构建方法，以具有优良的葡萄糖和木糖发酵能力的工业絮凝型酿酒酵母菌株为出发菌株，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将编码目标转录因子的基因 (HAA1和TYE7)和功能基因(FDH1)的启动子替换为在各典型抑制物胁迫下表达量较高且稳定的UBI4的启动子，以期达到高表达的目的。待获得目标转化子后，通过合成培养基批次发酵及秸秆水解液发酵评价转化子的性能，获得一株耐受乙酸和糠醛能力较强的菌株。

本发明为解决上述技术问题采用以下技术方案：

本发明的第一方面是提供一株耐乙酸和糠醛的发酵菌株，其为SEB16，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏编号为CGMCC No.19589，保藏日期为2020年04月20日，保藏单位为中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的第二方面是提供上述耐乙酸和糠醛的发酵菌株的构建方法，将出发菌株SEB5的HAA1、TYE7和FDH1基因的启动子通过CRISPR/Cas9基因编辑技术替换为UBI4启动子，便构建了上述耐乙酸和糠醛的发酵菌株SEB16。

进一步地，上述构建方法具体包括如下步骤：

步骤一，修复片段(UBI4启动子)的扩增：以菌株SEB5的基因组DNA为模板，通过PCR扩增UBI4启动子并纯化；

步骤二，构建双链gRNA片段并扩增gRNA线性骨架：确定HAA1、TYE7 和FDH1基因启动子的PAM位点，构建双链gRNA片段；以pMEL13质粒为模板，引物为SEQ ID No.17～18，进行PCR扩增得到gRNA线性骨架并纯化；

步骤三，连接上述gRNA片段和消化后的gRNA线性骨架，然后转化，获得gRNA质粒；

步骤四，将提取的Cas 9质粒转入菌株SEB5中，然后进行涂布平板培养并筛选、PCR反应验证获得含Cas 9质粒的酿酒酵母；

步骤五，将上述gRNA质粒和修复片段转入含Cas 9质粒的酿酒酵母，然后进行涂布平板培养并筛选、PCR反应验证获得耐乙酸和糠醛的发酵菌株SEB16 菌落。