[发明专利]自动化分离系统快速提取COVID-19患者康复期血浆的方法

权利要求书

1.快速分离获取用以制备静注COVID-19免疫球蛋白G的血浆的方法，其包括如下步骤：

(1)、通过静脉穿刺法采集的SARS-CoV-2自然感染并通过血清抗体滴度/血清中和抗体滴度确认后的康复者的外周血250mL，置血液采集袋内，将血液采集袋置于水平摇床上充分混匀15分钟；

(2)、使用封闭式多细胞组分自动化分离系统，将一次性使用分离杯的塑料针头插入到血液采集袋上的无菌接口内，将采血袋挂起，使其中的60ml血液自然流入分离杯内的中央舱室；在加入血液前所述中央舱室内预先添加有0.6ml分离助剂；用无菌接合仪焊接管路将血液采集袋与一次性分离杯分离，再使该一次性分离杯置于水平摇床上充分混匀10分钟；所述分离助剂是包含油酸钠和硫酸镁的灭菌水溶液，其中油酸钠浓度为5%，硫酸镁浓度以镁离子计为0.5mol/L；所述封闭式多细胞组分自动化分离系统是ThermoGenesis Corp.生产的PXP® System；

(3)、将一次性分离杯配平后放置于可编程的离心机进行离心操作，并按照如下程序设定离心机的参数：

在离心的初始高速部分即2000RCF期间，外周血样本中的细胞通过密度分层在一次性使用分离杯中分为三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；

将速度降低至50RCF，并且在此第一次低速离心期间，大部分红细胞被引导至红细胞回收舱；

短暂增加速度至500RCF，以进一步将处理室中的细胞分层；

再次降低至50RCF，进一步除去红细胞；

在采集血浆之前，相对离心力短暂增加至250RCF，在此期间，细胞浓缩层和血浆进一步分层；

再次降低至50RCF，细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，使大部分血浆保留在中央舱室中；

(4)、离心机减速并停止旋转，在一次性分离杯中分别单独采集红细胞、细胞浓缩层、血浆；

(5)、利用无菌接管机连接一次性分离杯上中央舱室的管路和转移袋的管路，将中央舱室中的分离后的血浆转移至转移袋内；用无菌接合仪焊接管路后，将分离后的血浆用亚甲蓝光化学法病毒灭活，然后在6h内快速冻结至-20℃以下，保存，得到血浆，其备用于制备静注COVID-19免疫球蛋白G的制剂。

2.根据权利要求1的方法，其所获得的血浆中丙氨酸氨基转移酶活性低于40U/L。

3.根据权利要求1的方法，其所获得的血浆之HbsAg、梅毒、HIV-I、HIV-II抗体、HCV抗体用经批准的检测试剂盒检测后为阴性。

4.根据权利要求1的方法，其所获得的血浆中，蛋白质含量高于50g/L。

5.根据权利要求1的方法，步骤(1)所述血液采集袋内包含抗凝剂。

6.根据权利要求5的方法，其中所述抗凝剂是枸橼酸钠。

7.根据权利要求1的方法，所述分离助剂是照如下方法配制的：将规定量的油酸钠和硫酸镁溶解于注射用水中，用0.45µm微孔滤膜过滤，封装于玻璃瓶中，121°C热压灭菌15分钟，即得。

8.制备静注COVID-19免疫球蛋白G制剂的方法，该方法包括如下步骤：

(1)如权利要求1~7任一项所述获得血浆组分；

(2)采用低温乙醇法沉淀血浆，得到组分I+II+III；

(3)组分I+II+III压滤后，组分II与组分I+III分离；

(4)组分II的沉淀溶解及柱层析纯化后超滤，得到免疫球蛋白G半成品1；

(5)组分I+III的沉淀溶解及柱层析纯化后超滤，得到免疫球蛋白G半成品2；

(6)将半成品1、2合并，除菌过滤和灭活病毒后，得到COVID-19免疫球蛋白G原液；

(7)免疫球蛋白G原液经配制、分装，得到可供静脉注射使用的静注COVID-19免疫球蛋白G制剂。

9.根据权利要求8的方法，其包括如下步骤：

(1)如权利要求1~7任一项所述获得血浆组分；

(2)将步骤(1)所得冻存的血浆置于融浆罐内进行融化，离心除去冷沉淀，用生理盐水稀释至血浆的蛋白含量在4.5~5.5g/L范围内，调节至pH5.95±0.05，接着缓慢添加乙醇使乙醇浓度达到19%，静置10~12h，压滤至过滤液澄清透亮，压滤机上的沉淀即为组分I+II+III；将组分I+II+III沉淀用10倍重量的0～4℃低温注射用水溶解，调整pH值至4.70～4.80并充分搅拌，接着调整pH值至5.20±0.05并继续搅拌；缓慢添加乙醇使乙醇浓度达到14%，调整pH值至5.20±0.05，在-3.5℃ ~ -4.5℃温度范围内放置12h；向物料罐中添加助滤剂，压滤至过滤液澄明透亮时，分离出包含组分I+III的沉淀、包含组分II的上清，向组分II中添加乙醇至乙醇浓度为25%，压滤，得到包含组分II的沉淀物；

(3)将步骤(2)所得组分II沉淀用注射用水溶解稀释后加助滤剂深层过滤至溶液澄清透亮；上样至DEAE Sepharose Fast Flow凝胶柱，用pH4.0醋酸洗脱液进行洗脱，截留的目标组分用孔径为30kD的超滤膜进行超滤透析至蛋白含量≥50g/L，得到免疫球蛋白G半成品1；

(4)将步骤(2)所得组分I+III沉淀用20mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液搅拌溶解，升温至20℃±1℃，喷淋方式加入正辛酸至浓度为20mmol/L后，剧烈搅拌以沉淀杂质蛋白，用压滤机压滤，获得澄清透明的滤液，收集上清溶液；将该上清溶液调节pH至5.7±0.3，0.22μm膜过滤，加载到Macro cap Q离子交换柱上用醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱进行柱层析，收集的洗脱液用纳米膜过滤，除去包括细小病毒在内的潜在病毒，得到滤液；滤液调整pH4.2±0.2，用含40mmol/L醋酸溶液的注射用水进行超滤脱盐，超滤膜截留规格为10kDa的相对分子质量，使制品pH维持在4.5±0.05、电导率≤1ms/cm后，进行浓缩，得到蛋白质含量大于50g/L的制品，其为免疫球蛋白G半成品2；

(5)将步骤(3)和步骤(4)所得半成品1和半成品2混合，经纳滤除菌、低孵放灭活病毒后，得到作为半成品的免疫球蛋白G原液，其亦称为静注COVID-19免疫球蛋白G原液；接着将该静注COVID-19免疫球蛋白G原液用0.9%氯化钠注射液稀释配制成可供静脉注射使用的静注COVID-19免疫球蛋白G制剂，即为成品。