[发明专利]一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒及其制备方法

说明书

本发明提供一种同时检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒及其制备方法，属于试剂盒领域。该试剂盒包括实时检测自吸阀分隔式芯片；所述的实时检测自吸阀分隔式芯片包括：自吸阀分隔式芯片、单核细胞增多性李斯特菌的FAM染料修饰特异性适配体、副溶血性弧菌的FAM染料修饰特异性适配体、鼠伤寒沙门菌的FAM染料修饰特异性适配体、空白对照FAM染料修饰适配体、HNB染料和氧化石墨烯。本发明对单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的最低检测浓度分别为46.8、22.9和32.3CFU/mL，加标回收率达到97.11～10.40％，灵敏度高，稳定性好。

技术领域

本发明属于试剂盒领域，具体涉及一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒及其制备方法。

背景技术

随着经济的发展及人民生活水平的提高，人口增长速度不断加快，造成了流动人口的增加和饮食习惯的变化，随之带来的是消费者对新鲜和低加工食品的需求提高，加之食源性病原菌对环境的高度适应性，使得食源性病原菌一直是各国的主要公共卫生问题之一，每年都造成巨大的经济损失。对美国的一项调查数据的评估显示，每年约有940万人感染食源性疾病，其中三分之一以上是由食源性病原菌感染引起。以单核细胞增多性李斯特菌为例，该病原菌可引起肠胃炎和发烧等症状，但因为常规粪便培养无法检测到该病原菌，使得有时临床诊断不会将这种病原菌感染作为诊断结果，从而导致延误病情，与之相关的早期自然流产或流产也可能被忽略。因此，建立快速有效的食源性病原菌检测方法至关重要。

传统的分离鉴定方法简单、稳定，但长达一周的检测时间使得其无法满足快速检测的需要。此外比较常用的的免疫学方法则通常利用抗原和抗体结合，辅以不同的技术以检测不同的靶标物质，例如酶联免疫法，免疫荧光法，免疫胶体金法等。但抗体的制备通常需要很长时间，使用前需要对其效价进行表征，对于其在长期储存状态下的活性维持也是需要考虑的问题。与之相比，适配体的优点自然体现，不仅易于合成，其在低成本和高稳定性方面表现出的性能也同样优异，并且在特异性方面可与抗体媲美的属性使得它们在近年来的实际应用中被广泛使用。

与此同时，PDMS材料凭借其良好的透光率，低成本，光学透明性，出色的可塑性和弹性以及从模具中获得的高保真度等优势被广泛认知和应用，例如微流控芯片与成熟的PCR技术的结合在扩增速度，检测限，样品需求和检测精度等方面显示出许多出色的性能。因此，如何紧跟研究趋势借助现有高优势材料实现对目标病原菌的检测，又能简化操作，在短时间内获得精准的检测结果就成为我们下一步检测技术的目标，对于传染源及病患的确定也显得至关重要。

发明内容

本发明目的是提供一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒及其制备方法，该试剂盒基于目标菌与其FAM修饰的特异性适配体结合恢复荧光，结合HNB荧光染料实现荧光信号双重检测，能够快速、灵敏、简便地检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌。

本发明首先提供一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒，该试剂盒包括实时检测自吸阀分隔式芯片；

所述的实时检测自吸阀分隔式芯片包括：自吸阀分隔式芯片、单核细胞增多性李斯特菌的FAM染料修饰特异性适配体、副溶血性弧菌的FAM染料修饰特异性适配体、鼠伤寒沙门菌的FAM染料修饰特异性适配体、空白对照FAM染料修饰适配体、HNB染料和氧化石墨烯。

本发明还提供一种检测单核细胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门菌的试剂盒的制备方法，包括：

步骤一：自吸阀分隔式芯片的制备

1)模具的制备