[发明专利]一种大肠杆菌电化学检测方法

权利要求书

1.一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的大肠杆菌电化学检测方法，包括以下步骤：

将2μM ssDNA A和2μM ssDNA B在95℃加热10min缓慢冷却至室温形成含N₃基团的双链DNA dsDNA，对金电极预处理，再将上述双链DNA dsDNA固定在金电极表面；随后将修饰后的金电极浸泡在含50μL 4mM PBIB、5μL 2mM CuSO₄和1mL OD₆₀₀＝0.1大肠杆菌菌液的点击反应溶液中，并在37℃下避光孵育40min；Cu²⁺被大肠杆菌中的铜还原酶NDH-2还原为Cu⁺，并催化N₃基团与溴代异丁酸丙炔酯PBIB发生叠氮炔环加成反应；将完成点击反应后的金电极置入含有50μL 10mM FMMA、50μL 10mM Cu²⁺/Me₆TREN、500μL 1M KBr、900μL DMF和3500μL0.1mM KPF₆的溶液中，通过施加电压使大量FMMA通过eATRP反应连接聚合在dsDNA末端；最终进行电化学测定，经方波伏安法SWV测定电流强度与大肠杆菌浓度呈正相关，绘制电化学信号与大肠杆菌浓度之间的标准曲线得到线性方程，测量待测样品的电化学信号通过计算即可实现大肠杆菌的灵敏检测；

上述ssDNA A、ssDNA B序列分别如下：

ssDNA A：5’-GCT TAG CCT CAA CCC CCA-3’

ssDNA B：5’-N₃-TTT TTT TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA CTC GGA ACC CCC A-(CH₂)₆-SH-3’。

2.根据权利要求1所述的一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的大肠杆菌电化学检测方法，其中大肠杆菌培养的步骤如下：大肠杆菌在LB培养基中生长过夜，通过离心在指数生长期收获，弃去上清，然后将细菌颗粒重悬于PBS中，通过测量600nm处的光密度OD，可以对细菌浓度进行监测，在进行细菌比色检测实验前，将菌种原液的OD₆₀₀值调整为0.1。

3.根据权利要求1所述的一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的大肠杆菌电化学检测方法，其中金电极预处理的步骤如下：用800目、1000目、2000目及5000目砂纸打磨金电极各3-5min；然后用0.3μm和0.05μm的氧化铝悬浮液分别抛光裸露的金电极，再依次用99.99％的乙醇和超净水进行超声清洗；再将所处理过的金电极浸泡在新制备的水虎鱼溶液中10min；之后将电极放在0.5M H₂SO₄中用循环伏安法在-0.2-1.5V的电位范围内以0.1Vs^-1的扫速进行电化学处理，直至获得稳定的循环伏安图；最后用超净水冲洗电极表面，并用氮气吹干。

4.根据权利要求1所述的一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的大肠杆菌电化学检测方法，其中dsDNA固定在金电极的步骤如下：将10μL 1μM双链DNA dsDNA滴加到干净的金电极上并在37℃下孵育1.5h；然后金电极用TE缓冲溶液冲洗两次；随后将金电极浸泡在2mM溶解于70％酒精的MCH溶液0.5h；再用TE缓冲液冲洗电极。

5.根据权利要求1所述的一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的大肠杆菌电化学检测方法，其中进行eATRP的步骤如下：将完成点击反应后所得的金电极用TE溶液冲洗十秒；随后放入含有50μL 10mM FMMA、50μL 10mM Cu²⁺/Me₆TREN、500μL 1M KBr、900μL DMF和3500μL 0.1mM KPF₆的溶液中，并在其表面施加一个恒定的负电位-0.53V反应40min；再用线性伏安扫描法LSV扫描以去除沉积在电极表面的铜，其设置为：初始电位0V；最终电位0.2V；扫描速率1.0Vs^-1；最后用DMF和超纯水清洗电极。

6.根据权利要求1所述的一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的大肠杆菌电化学检测方法，其中电化学测定的步骤如下：将eATRP反应后的金电极放入1.0MLiClO₄溶液中并用方波伏安法SWV对电极进行检测，其设置为：初始电位0V，终止电位0.6V，电位增量4.0mV，脉冲幅值25mV，频率15Hz。