[发明专利]一种用于检测蜡样芽孢杆菌的液相芯片及应用

说明书

本发明提供了用于检测8种蜡样芽孢杆菌的DNA序列，连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的DNA探针，包括：从蜡样芽孢杆菌G6235、G6206、G6239、G2724、G6211、G6217、G6207、G6214中分别选取的一种DNA片段。本发明结合Bio‑Rad公司的Bio‑Plex 200悬液芯片系统，建立了一套用于检测8种蜡样芽孢杆菌的悬液芯片检测系统及其检测方法，填补了利用分子生物学方法对蜡样芽孢杆菌检测的技术空白，对于这一重要致病菌的临床鉴定和流行病学监测具有重要意义。

技术领域

本发明属于细菌检测方法技术领域，涉及用于8种蜡样芽孢杆菌检测的液相芯片及应用。

背景技术

蜡样芽孢杆菌是一种兼性厌氧型革兰氏阳性菌，广泛存在于土壤﹑水﹑空气﹑动物肠道中，与人类关系密切。由于蜡样芽孢杆菌是引起食物中毒的常见细菌，主要污染淀粉制品、乳和乳制品，特定条件下可产生肠毒素，可引起人的呕吐型和腹泻型食物中毒。

我国2013年发布的出入境检验检疫行业标准（SNT0176-2013）和2014年发布的国家标准（GB4789.14-2014）中，对于食品中蜡样芽孢杆菌的检测均采用在获得细菌纯培养物的基础上，进行生化鉴定或菌落计数的手段，检验周期在48-72小时之间，试验耗时长、且准确性不高；最新2014年发布的出入境检验检疫行业标准（SNT3932-2014）中，建议采用实时荧光定量PCR的方法对蜡样芽孢杆菌进行鉴定，虽然检测时间有所缩短，但仍需要对于待检测样品进行9-18小时的培养。上述检测方法只能将蜡样芽孢杆菌检测至种的水平，且检测通量低，难以满足菌株流行性溯源和快速检测的需求。

血清学检测方法具有操作简便和结果判读直观的特点，自上世纪30年代以来被广泛应用，被认为具有最好的特异性和灵敏性，该方法可有效区分一个种/属中不同致病性的菌株。目前，大多数重要致病菌都建立了基于表面多糖抗原的血清学分型系统，并且该分型体系已被广泛应用于检验检疫和疾病预防控制系统。然而，传统血清学鉴定方法虽被广泛使用，但仍存在诸多缺陷。主要包括：1）建立血清学分型系统的工作繁琐、周期长；2）抗血清的生产和质控较为困难；3）很多抗血清国际上只有少数几家单位生产和保存，且用于鉴定的抗血清严重不全；4）血清学鉴定的实验过程耗时较长（2-6天）。

建立与传统血清学方法相对应的高通量分子甄别技术，不但可大幅度提高细菌血清型鉴定的速度、准确性和通量，而且可使基于传统血清学鉴定和分子生物学鉴定的各种流行病学数据之间能够有效整合、协调，并可让使用不同细菌鉴定技术的实验室之间能够进行数据交流，从而有利于传染病多层次防控体系的建立。液相芯片是芯片技术与流式细胞术相结合的新技术。即将DNA、抗体等附着于微球表面作为探针，在液相中与待测物结合，再加入荧光标记的报道分子，借助流式细胞仪检测微球表面荧光标记物。除了具有高通量、特异性高和灵敏度高等特点外，与传统的固相芯片比较，其还具有信号收集和处理快速、操作简便、成本相对低廉等特点。近年来，随着液相芯片技术的逐渐成熟，其正逐步用于科研和多个分子生物学诊断实验室，并逐渐商业化，显示了较好的应用前景。

细菌表面多糖抗原主要包括O多糖（O抗原）、普通抗原（CA）、胞外多糖抗原、芽孢、以及荚膜多糖（K抗原）等。其中，O多糖（O抗原）和荚膜多糖（K抗原）的结构多样性，是细菌血清型分型的基础。而同一细菌内O抗原和/或K抗原的多样性，是由于编码合成O抗原和/或K抗原的各种酶的基因的遗传多样性决定的。这些基因往往成簇地位于基因组上的固定位点，被称作O抗原基因簇和/或K抗原基因簇。根据前期研究，蜡样芽孢杆菌的细菌表面多糖抗原基因簇均位于编码DNA结合调控因子的基因和fabZ两个持家基因之间，且基因簇信息已被破译，这使得采用分子生物学方法，实现对上述蜡样芽孢杆菌的分子血清学检测成为可能。

发明内容