[发明专利]一种利用酵母表达系统有效表达NaD1蛋白的方法

权利要求书

1.花烟草NaD1基因构建载体pPIC9K-NaD1，其碱基序列如SEQ No.1。

2.花烟草NaD1基因的工程菌，其受体菌为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，转入有权利要求1所述的载体pPIC9K-NaD1。

3.一种利用酵母表达系统有效表达NaD1蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)将花烟草NaD1基因双酶切连接至pPIC9K载体的EcoR I和Not I间构建重组质粒pPIC9K-NaD1，重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

(2)质粒经Sac I内切酶线性化后进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物；电转化回收产物于GS115感受态细胞中，获得重组阳性克隆；

(3)将重组阳性克隆接种于BMGY液体培养基中，30℃ 200rpm条件下培养，然后，离心去液体培养基上清液，再接种于BMMY培养基中，加入消泡剂，30℃ 200rpm条件下培养，培养完成后，再加入10mL甲醇诱导，30℃ 200rpm培养，8000rpm离心，取上清液，所述上清液中含有可溶性NaD1蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，所述BMGY液体培养基中培养24小时，在BMMY培养基中，加入泡敌消泡剂培养24小时再加入甲醇诱导，继续培养24小时。

5.根据权利要求4所述的方法，所述步骤(3)后还包括纯化步骤：A、将上清液用1M且pH9.0的Tris液体，调节浓缩过的上清液至pH 8.0；选用过滤规格为0.22μm的过滤器过滤，得上清蛋白溶液，B、上清蛋白溶液上样至准备好的镍柱，以pH8.0的NTA-0缓冲液洗镍柱至流出液体不含蛋白，C、以咪唑溶液洗脱，收集G250检测显蓝色的区段的洗脱液，再经超滤管超滤浓缩，得到可溶性NaD1蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法，所述咪唑溶液浓度为250mM，超滤管规格为10kDa。