[发明专利]靶向GPC3的CAR及应用其的CAR-NK细胞

说明书

本发明提供一种GPC3靶向性嵌合抗原受体，包括依次串联的特异性识别GPC3的单链抗体、跨膜区结构域和胞内区结构域；所述嵌合抗原受体的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明GPC3靶向性的嵌合抗原受体可以显著提高NK细胞对肝癌细胞的杀伤性，且转导率高。

技术领域

本发明属于细胞免疫治疗领域，具体地，涉及一种靶向GPC3的CAR及应用其的CAR-NK细胞。

背景技术

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是肝脏的原发性上皮性肿瘤，常与潜在的病毒性、代谢性、自身免疫性或酒精性慢性肝病相关。肝细胞癌是原发性肝癌的主要形式之一，占所有原发性肝癌的85-90％。

肝细胞癌的治疗取决于疾病分期，通常分为非常早期、早期、中期、晚期和末期(终末)，并针对每个阶段进行适当的治疗。患有早期肝细胞癌(A期，无症状的早期肿瘤)的患者可以选择可能的治疗选择(肿瘤切除，移植或消融)。患有中期肝细胞癌的患者(B期，无症状的多结节性肝癌)一般使用化学栓塞(TACE)治疗。肝细胞癌晚期(C期，症状性肿瘤，血管浸润或肝外转移)者应使用索拉非尼治疗，那些先前具有索拉非尼耐受性的患者可以用雷戈非尼治疗。末期肝细胞癌患者(D期)仅能接受保守治疗。早期的肝细胞癌通过手术切除还具有治疗完全缓解的可能，但随着分期演进，肝细胞癌治疗后复发率和死亡率极高，因此亟待新的治疗手段。

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞是最受关注的肿瘤免疫疗法之一，该技术通过在T细胞中转染嵌合抗原受体，使T细胞可以特异性靶向肿瘤表面抗原，同时胞内段结构域可以提供第一和第二信号活化T细胞，使其成为具有精确靶向性、并持续维持杀伤活性的新一代细胞治疗技术，在多种肿瘤中特别是血液系统肿瘤的治疗中表现出了极佳的疗效。2017年间FDA已批准了两个CAR-T细胞免疫疗法上市，分别为诺华的Kymriah(CTL019)治疗复发或难治性儿童和成人B细胞急性淋巴细胞白血病，Kite的Yescarta(KTE-C19)治疗成人复发或难治性B细胞淋巴瘤。这一成果，成为CAR-T细胞治疗进程中的里程碑。但与此同时，安全性也成为困扰CAR-T临床应用的一大难题:细胞因子风暴、脱靶效应、严重的过敏反应和神经毒性，以及病毒载体带来的安全隐患严重限制了CAR-T的进一步推广。

相比于T细胞杀伤的模式，NK细胞的杀伤模式对抗体亲和力要求更低，抗体选择范围更大；且NK细胞几乎不引起移植物抗宿主病D，因为成熟NK在体内寿命相对T细胞要短得多(一般7-10天)，近年来己逐步考虑采用NK细胞作为CAR的载体细胞。对于原代NK细胞或者细胞系的改造，主要是借鉴在CAR-T上积累的经验，但也有研究团队针对NK细胞的特点进行设计改造。例如有的研究人员为了提高CAR-NK对肿瘤细胞的特异性识别效果，将胞外结构域设计为NK细胞表面活化性受体的配体。

CAR分子由负责靶向识别抗原的胞外结构域(受体胞外段或者单链抗体结构域(scFv，Single Chain Fragment Variable))、提供伸展性的铰链区、跨膜区、胞内段联合共刺激分子组成。胞内信号转导域的结构可决定嵌合抗原受体修饰后的免疫细胞活化信号的强弱，从而影响其抗肿瘤的效果。随着研究进展，研究人员发现不同的胞内结构域具有不同的抗肿瘤特性，因此需要根据不同的肿瘤、不同的宿主细胞选择合适的CAR分子。而且，目前针对NK细胞CAR的结构改造尚缺乏研究。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)是细胞膜表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)，其在肝癌组织中高表达(阳性率高达74.8％)，而在正常肝组织中几乎不表达，是一种较为理想的肿瘤治疗靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CAR(嵌合抗原受体)及应用其的CAR-NK细胞，以有效激活免疫功能细胞并使免疫功能细胞高效地杀灭肝癌细胞。