[发明专利]含有CAR核酸片段的表达质粒、含该表达质粒的靶向CD105的CAR-T细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种含有CAR核酸片段的表达质粒，所述CAR核酸片段为嵌合抗原受体CD105 Nb‑CD8‑CD137‑CD3ζ片段，由CD105 Nb、CD8铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。本发明还涉及转染有本发明第一方面所述的表达质粒的工程化CD105靶向性CAR‑T细胞及其制备方法。本发明还涉及所述表达质粒在制备所述CAR‑T细胞中的应用以及所述CAR‑T细胞在制备用于治疗肿瘤制剂中的应用。本发明的CAR‑T细胞在对CD105阳性肿瘤细胞具有显著的杀伤作用，从而为肿瘤的过继治疗提供了新策略。

技术领域

本发明属于肿瘤生物制品领域，具体涉及含有CAR核酸片段的表达质粒、含该表达质粒的靶向CD105的CAR-T细胞及其制备方法和在例如过继免疫治疗中的应用。

背景技术

近年来免疫治疗已逐渐成为肿瘤治疗领域的焦点，其中免疫细胞过继治疗成为研究的热点，基于嵌合抗原受体修饰T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell，CAR T)的免疫疗法已经证明是一种有希望的癌症治疗策略。嵌合抗原受体T细胞通过提取患者体内的T细胞，利用基因工程技术使识别肿瘤特异性抗原的受体表达在T细胞表面，T细胞绕过抗原提呈阶段以及MHC(major histocompatibility complex，主要组织相容性复合体)的限制，特异性识别和攻击杀伤肿瘤细胞。由于是诱导、激活自体细胞，因此该疗法没有放疗和化疗的毒副反应。

CAR-T细胞是由抗原识别结构域(配体或单链抗体scFv)、铰链区、跨膜区和胞内信号区连接而成。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性都是关键的决定因素。CD105，又称Endoglin，是血管内皮细胞增殖相关膜抗原，被认为是新生血管内皮细胞的特异标志分子之一，表达于实体肿瘤新生血管及相关肿瘤细胞表面，与某些癌症的预后密切相关，表明CD105可作为有吸引力的血管内皮靶标。CAR-T细胞的胞外抗原识别区通常为单链可变片段(single chain variable fragment,scFv)，由重链可变片段通过柔性连接轻链可变片段组成。然而scFv并不总是有效折叠，并倾向于聚集。纳米抗体(Nanobody，Nb)由重链的可变区(variable domain of the heavy chain of HCAbs，VHH)构成，体积小(宽2.5nm，长4.2nm)，分子量小(约为15KDa)，可以快速扩散至全身，并且具有良好的组织穿透能力。Nanobody基因序列与人VH基因家族3序列具有高度同源性，所以在人体内的免疫原性低。因此Nanobody可以作为产生肿瘤抗原特异性CAR-T细胞的理想抗原识别区域。CAR-T的制备大多采用慢病毒转染，易产生插入突变等问题。CRISPR/Cas 9技术是备受关注的一项新兴基因编辑技术，CRISPR/Cas 9系统由非特异性的Cas 9蛋白和一系列具有片段特异性的CrRNA(CRISPR RNA)组成，这些CrRNA能够在靶向位置引导Cas 9剪切DNA并产生双链断裂，然后细胞会借助同源重组机制或者非同源末端连接机制对断裂的DNA进行修复，产生所需要的基因的定点插入、删除或者靶向位置的基因替换。

恶性肿瘤已成为目前危害人类身体健康最严重的疾病之一，肿瘤传统治疗手段有手术、化疗和放疗，传统方法虽然能使病情缓解，但存在肿瘤复发率高、化疗耐药以及严重影响生活质量等问题。近年来综合治疗提高了肿瘤的治疗效果，但仍相当一部分患者复发或对常规治疗产生耐药，为此我们提出了含有CAR核酸片段的表达质粒、含有该表达质粒的一种CD105靶向性CAR-T细胞及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用。

发明内容

为了解决现有技术中的一个或多个技术问题，本发明在第一方面提供了一种含有CAR核酸片段的表达质粒，所述CAR核酸片段为嵌合抗原受体CD105VHH-CD8-CD137-CD3ζ片段，由CD105 VHH、CD8铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。

本发明在第二方面提供了一种工程化CD105靶向性CAR-T细胞，所述CAR-T细胞转染有本发明第一方面所述的表达质粒。