[发明专利]含有CAR核酸片段的表达质粒、含该表达质粒的靶向CD105的CAR-T细胞及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种含有CAR核酸片段的表达质粒，其特征在于，所述CAR核酸片段为嵌合抗原受体CD105 Nb-CD8-CD137-CD3ζ片段，由CD105 Nb、CD8铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。

2.根据权利要求1所述的表达质粒，其特征在于，所述CAR核酸片段如SEQ ID NO.1所示；优选的是，所述表达质粒为插入有所述CAR核酸片段的Puc-donor质粒。

3.一种工程化CD105靶向性CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞转染有权利要求1或2所述的表达质粒。

4.根据权利要求3所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞还转染有包含人AAVS1基因的gRNA识别序列的第二质粒；优选的是，所述gRNA识别序列如SEQ ID NO.2所示；更优选的是，所述第二质粒为插入有所述gRNA识别序列的px330质粒。

5.一种用于制备权利要求3或4所述的CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)制备权利要求1或2所述的表达质粒；

(2)将所述表达载体转染到T细胞中，从而获得CAR-T细胞的方法。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述CAR核酸片段通过如下方法制备：

(I)合成嵌合抗原受体CD105 VHH-CD8-CD137-CD3ζ核酸片段；

(II)将所述核酸片段克隆至表达载体p LVX中，得到插入有所述核酸片段的pLVX-CAR质粒；

(III)利用pLVX-CAR质粒通过PCR扩增所述核酸片段；

(IV)将扩增得到的所述核酸片段插入到Puc-donor载体质粒中，得到插入有所述核酸片段的Puc-donor-CAR质粒；

优选的是，在将扩增得到的所述核酸片段插入到Puc-donor载体质粒中时采用限制性内切酶KpnⅠ/HindⅢ对Puc-donor载体质粒进行双酶切。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括另外用包含人AAVS1基因的gRNA识别序列的所述第二质粒转染T细胞，从而获得同时转染有权利要求1或2所述的表达载体和所述第二质粒的CAR-T细胞；

优选的是，在将所述核酸片段克隆至表达载体p LVX中时采用限制性内切酶EcoR I/Not I对表达载体p LVX进行双酶切；

更优选的是，所述包含人AAVS1基因的gRNA识别序列通过如下方法合成：

(i)在人AAVS1基因外显子序列上，根据CRISPR/cas9基因编辑技术对sgRNA的要求设计并合成19～23个碱基的单链gRNA识别序列，再合成所述识别序列的反向互补序列，从而得到双链gRNA识别序列；

(ii)使用限制性内切酶Bbs I将pX330质粒进行酶切，并通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物，使用T4 DNA连接酶将双链gRNA识别序列和经过酶切的pX330质粒酶切产物进行连接，获得插入有gRNA识别序列的px330-gRNA质粒。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其特征在于，通过如下方法将权利要求1或2所述的表达质粒和所述第二质粒同时转染至T细胞中：激活T细胞；将所述表达质粒和所述第二质粒混合并加入到电转杯中，以100V电压、5ms、1次电容条件下将所述表达质粒和所述第二质粒电转染至所述激活T细胞中，利用RIPM 1640完全培养基对经过电转染的激活T细胞进行培养，得到所述CAR-T细胞。

9.权利要求1或2所述的表达质粒在制备权利要求3或4所述的CAR-T细胞中的应用。

10.权利要求3或4所述的CAR-T细胞在制备用于治疗肿瘤制剂中的应用；

优选的是，所述肿瘤为CD105阳性肿瘤，更优选的是，所述肿瘤为肝肿瘤，尤其优选的是，所述肿瘤为由选自由肝癌细胞Bel7404、HepG2、SMCC7721和MHCC97H组成的组的肝癌细胞导致的肝肿瘤。