[发明专利]一种CYFRA21-1测定试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种CYFRA21-1测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述CYFRA21-1测定试剂盒包括R试剂、M试剂和校准品，所述制备方法包括：

M试剂的制备：将磁珠包被后的抗体用M稀释液按照1:20的比例进行稀释，得到M试剂，所述M稀释液包括100mM PB、0.1%Tween20、0.5%BSA和0.1%PC-300，pH为7.5，所述磁珠包被后的抗体为氯甲基磁珠包被CYFRA21-1抗体，具体为：

（1）取10mg/mL氯甲基磁珠0.2mL于离心管中，去除上清液，用0.5mL的磁珠清洗液进行磁性分离洗涤3次，去除上清液，所述磁珠清洗液包括100mM MES和0.05%Tween20，pH6.0；

（2）加入100μg的捕获抗体和0.5mL的偶联缓冲液，25℃偶联2-3h，偶联期间保持磁珠的悬浮状态，偶联完成，去除上清液，所述偶联缓冲液包括100mM硼酸溶液，pH8.0-8.5；

（3）加入0.5mL封闭缓冲液，25℃反应1h，封闭磁珠表面未反应的活化基团，保持磁珠悬浮状态，封闭完成，去除上清液，用洗涤液清洗3次，所述封闭缓冲液包括100mM PBS和1%BSA，pH7.2；

（4）加入1mL保存液保存，得到磁珠包被后的试剂M，保存在2-8℃条件下，所述保存液包括100mM Tris、0.1%PC-300，pH8.0；

R试剂的制备：将酶标记抗体用R稀释液按照1:500的比例进行稀释，得到R试剂，所述R稀释液包括100mM的Tris，0.9%NaCl，4mM MgCl₂，0.4mM ZnCl₂，0.1%PC-300，5%甘油，1%BSA，5%胎牛血清，pH为6.5；所述酶标记抗体的制备方法为：

取0.5mg的检测抗体，加入50mM的DTT还原剂，室温下反应30min，将抗体重链间的二硫键断开形成游离巯基；

另取0.4mg的碱性磷酸酶，加入0.2mL酶活化剂，室温下反应15min，用分子筛层析方式纯化，得到活化后的碱性磷酸酶；所述酶活化剂包括100mM Tris，0.3%NaCl，5mM EDTA，25mMSMCC交联剂；

将活化后的抗体与活化后的碱性磷酸酶按质量比1:0.8混合，加入0.01mL的1M MgCl₂，在2-8℃条件下反应12h，反应结束后用分子筛纯化，得到酶标抗体复合物；

按照1:1的体积加入甘油保存，得到酶标抗体，保存在-20℃条件下；

校准品的制备：将CYFRA21-1抗原用校准品稀释液配制成0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL的浓度，所述校准品稀释液包括50mM Tris，0.9%NaCl，0.2%Tween20，0.2%酪蛋白，1%BSA，0.1%PC-300，pH为7.5。

2.一种采用权利要求1所述的方法制备得到的CYFRA21-1测定试剂盒。