[发明专利]沿阶草AFLP分子指纹图谱库的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种引物对组合，其特征在于，所述引物对组合包括九组引物对，所述九组引物对包括引物E-AAG和引物M- CTC、引物E-AAG和引物M-CTT、引物E-AAG和引物M-CTG、引物E-ACG和引物M-CAG、引物E-ACA和引物M-CAC、引物E-ACT和引物M-CAA、引物E-ACT和引物M-CTC、引物E-ACG和引物M-CAC、引物E-ACG和引物M-CAG、引物E-ACG和引物M-CTA、引物M-CAG和引物M-CTT，所述引物E-AAG序列如SEQ ID NO：1所示，所述引物M- CTC序列如SEQ ID NO：2所示；所述引物M-CTT序列如SEQ ID NO：3所示，所述引物E-ACA序列如SEQ ID NO：4所示，所述引物M-CAC序列如SEQ ID NO：5所示，所述引物E-ACT序列如SEQ ID NO：6所示，所述引物M-CAA序列如SEQ ID NO：7所示，所述引物E-ACG序列如SEQ ID NO：8所示，所述引物M-CAG序列如SEQID NO：9所示，所述引物M-CTA序列如SEQ ID NO：10所示。

2.权利要求1所述的引物对组合在沿阶草种质鉴别或品种鉴定或AFLP分子指纹图谱库的构建中的应用。

3.一种沿阶草AFLP分子指纹图谱库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）沿阶草不同种质获得：通过收集多点多地区不同种质或品种的沿阶草及通过理化诱变剂诱导体细胞基因突变体胚再生获得不同种质沿阶草，将其种植成沿阶草种质资源圃；

2）沿阶草基因组DNA的提取：在生长季采集不同种质沿阶草的新鲜幼嫩叶片分别装袋带回实验室，采用CTAB法提取DNA；

3）沿阶草AFLP反应体系的建立与优化：将提取的不同种质沿阶草基因组DNA，经过酶切、连接、预扩增、选择性扩增、电泳步骤，得到各个种质的相应条带或指纹图谱，其中具有相同条带的被认为是拥有同样的遗传位点，具有不同大小的条带被认为拥有不同的遗传位点，由此获得沿阶草AFLP分子指纹图谱标记；

4）沿阶草AFLP指纹图谱库及分析：通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染后上测序仪扫描获得AFLP凝胶电泳分离图谱库，通过软件分析获得结果，按照相同迁移位点有扩增带记为1，无带为0的方法记录电泳谱带，并转化为“0、1”原始数据矩阵，进行遗传变异信息统计分析及亲缘关系多态性图谱分析，从而筛选出权利要求1所述的引物对组合从而构建沿阶草AFLP分子指纹图谱库。

4.根据权利要求3所述的沿阶草AFLP分子指纹图谱库的构建方法，其特征在于，所述步骤1）沿阶草包括矮生102、矮生256、黑色662、黑色602、矮生302、矮生303、矮生202、细叶471、矮生246、矮生241、黑色622、黑色612、矮生312、矮生322、矮生301、细叶502、矮生311、细叶411、矮生305、矮生315、矮生212、矮生232、黑色624、细叶486、矮生293、矮生111、细叶498、矮生263、矮生282、细叶456中的一种或几种。

5.根据权利要求3所述的沿阶草AFLP分子指纹图谱库的构建方法，其特征在于，所述步骤2）CTAB法为改良CTAB法。

6.根据权利要求3所述的沿阶草AFLP分子指纹图谱库的构建方法，其特征在于，所述步骤3）预扩增步骤中的预扩增引物序列如下：EcoR I 预扩引物序列: 5’-GAC TGC GTA CCAATT CA-3’，Mse I预扩引物序列: 5’-GAT GAG TCC TGA GTA AC-3’。

7.根据权利要求3所述的沿阶草AFLP分子指纹图谱库的构建方法，其特征在于，所述步骤3）选择性扩增中的扩增条件为：预变性 94℃2min；第一轮扩增参数：94℃30S，65℃30S，72℃80S；以后每轮循环退火温度递减0.7℃，扩增14轮；接着按下列参数扩增23轮：94℃30S，55℃30S，72℃80S；延伸加时72℃5min。