[发明专利]一种制备人源化ACE2小鼠模型的方法

说明书

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种制备人源化ACE2小鼠模型的方法，本发明能令对SARS‑CoV2有耐受性的小鼠得以被SARS‑CoV2感染，进而得以利用小鼠作为COVID19感染疾病模型。因小鼠的生长周期短、且成本低廉的优势，因此能够快速推进抗新冠病毒药物及疫苗的研发速度。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种制备人源化ACE2 小鼠模型的方法。

技术背景

新型冠状病毒肺炎疫情在全世界范围内的爆发引起了严重的公共卫生安全问题以及经济衰退。新冠肺炎的是由新型冠状病毒 (SARS-CoV2)感染引起的严重急性呼吸系统综合症，该病毒属于冠状病毒科的β冠状病毒亚属。新冠病毒经空气传播进入呼吸系统，发病后会引起包括发烧，干咳和肺炎在内的症状，导致呼吸困难。与其他包括2003年发现的SARS-CoV、2012年发现的中东呼吸综合症冠状病毒(MERS-CoV)和蝙蝠SARS相关冠状病毒(SARSr-CoV) 等β-冠状病毒相似，SARS-CoV2呈球形包膜上存在棘突，直径约为 80-160nm，内部有单股正链RNA基因组。SARS-CoV2包含四种结构蛋白，即包膜(E)，刺突(S)，膜(M)和核衣壳(N)。S，M 和E蛋白一起形成病毒的包膜。M蛋白含量最高，主要负责包膜的形状。E蛋白是最小的结构蛋白。S和M蛋白也是病毒在复制和装配过程中涉及的跨膜蛋白。N蛋白仍与病毒RNA基因组相关联，在包膜内部形成核衣壳(CDC，美国，https：//phil.cdc.gov/)。系统分析表明，蝙蝠冠状病毒RaTG13与SARS-CoV2具有高度相似性，在编码刺突蛋白的S基因中共有93.1％的序列同源性。然而，SARS-CoV和其他SARSr-CoV的S基因序列同源性与SARS-CoV2则相比少于80％的。

病毒与宿主细胞在感染位点之间的相互作用机制对于疾病的发生和发展至关重要。2003年引起SARS大流行的SARS-CoV和2020 年爆发的SARS-CoV2均通过刺突糖蛋白感染宿主细胞。此外，研究发现血管紧张素转化酶2(ACE2)是一种在气道上皮、I型和II型肺泡上皮细胞高度表达的膜锚定羧肽酶，是SARS-CoVs感染宿主细胞的受体。人类ACE2(hACE2)和小鼠ACE2(mACE2)基因位于X 染色体上，是编码区域(Coding Sequences,CDS)约2.4kb的同源基因，具有非常高的相似度。由于刺突蛋白结合域上的序列差异， mACE2不像hACE2一样能够有效地与SARS-CoVs结合，因此无法使用小鼠作为新冠病毒的感染模型(见附图1：人类与小鼠ACE2蛋白质序列分析)。作为替代方案，与人类的ACE2更接近的非人类灵长类动物已作为模式动物，已被用于SARS-CoV2治疗方案、药物及疫苗的研发。由于使用非人类灵长类动物的高成本和道德问题限制了新冠病毒治疗方法的研发进程，因此需要一种相对成本较低且有效的动物模型例如啮齿类动物。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术存在的问题，提供一种 ACE2人源化小鼠模型的建立方法，以应对全球对COVID-19治疗与疫苗研发小鼠模型的迫切需求。其技术关键点在于采用CRISPR/Cas9 与ssODN介导之同源重组，将小鼠基因组ACE2编码区域置换成人源ACE2编码区域，使小鼠能内源性表达人类SARS-CoV2病毒受体 ACE2。本发明发现小鼠ACE2的exon 2与exon 15具有易靶向插入外源性基因序列的特性，此外，为尽可能保持小鼠基因组完整性避免因矫作(artifact)造成小鼠表型异常，故本发明选择sgRNA靶向exon 2与exon 15，保留exon 15与exon 19之间的序列。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种制备人源化ACE2小鼠模型的方法，包括以下关键步骤：

打靶sgRNA、ssODN的设计：针对小鼠ACE2基因组序列的exon 2与exon 15的序列分别设计上下游两条sgRNA引物序列；针对小鼠ACE2 exon 2与人类ACE2编码区域5’端同源序列以及人类ACE2 编码区域3‘端与小鼠ACE2 exon 15同源序列设计上下游两条ssODN 序列。