[发明专利]一种制备人源化ACE2小鼠模型的方法

权利要求书

1.一种制备人源化ACE2小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下关键步骤：

打靶sgRNA、ssODN的设计：针对小鼠ACE2基因组序列的exon 2 与exon 15的序列分别设计上下游两条sgRNA引物序列；针对小鼠ACE2 exon 2与人类ACE2编码区域5’端同源序列以及人类ACE2编码区域3‘端与小鼠ACE2 exon 15同源序列设计上下游两条ssODN序列；

所述上下游sgRNA引物序列的5’端均带有T7启动子序列；

所述上游sgRNA的引物序列如SEQ ID NO.3所示；所述下游sgRNA的引物序列如SEQ IDNO.4所示；

所述上下游ssODN序列的5’端均包括人源ACE2编码区同源序列，所述上下游ssODN序列的3’端均包括小鼠ACE2基因组同源序列；

所述上游ssODN的序列如SEQ ID NO.5所示，所述下游ssODN的序列如SEQ ID NO.6所示；

上述制备人源化ACE2小鼠模型的方法，还包括以下步骤：

（1）人源ACE2编码序列的获取；

（2）打靶sgRNA、ssODN与Cas9 RNP制备：利用上下游sgRNA引物合成sgRNA，合成上下游ssODN，制备Cas9 RNP；

（3）小鼠受精胚胎的制备、培养与移植；

（4）人源ACE2编码序列敲入与敲除小鼠基因型检测：小鼠出生后21天离乳，采集尾组织用于鉴定；组织块在离心管内加入蛋白酶K后56℃裂解，利用Easy Prep HY Genomic DNAExtraction试剂盒提取组织DNA；以上述小鼠组织DNA作为模板，利用PCR针对人源ACE2编码序列定点插入小鼠ACE2基因组进行基因型鉴定；引物序列包括SEQ ID NO.9-16；

所述步骤（1）人源ACE2编码序列的获取中，上下游引物序列分别为SEQ ID NO.7和SEQID NO.8；

所述步骤（2）打靶sgRNA、ssODN与Cas9 RNP制备具体包括以下步骤：分别合成上下游sgRNA引物，利用EnGen^®试剂盒内含T7 RNA聚合酶进行体外转录，合成并纯化sgRNA到达浓度1000ng/ul，保存于-80°C备用；合成上下游ssODN，将Cas9重组蛋白、sgRNA、ssODN与人类ACE2编码序列DNA模板于室温混合达下列浓度：Cas9重组蛋白100ng/ul, sgRNA 50ng/ul,ssODN 100ng/ul，人类ACE2编码序列DNA模板20ng/ul。

2.如权利要求1所述制备人源化ACE2小鼠模型的方法在研发/制备针对新型冠状病毒疾病或严重急性呼吸道症候群冠状病毒2的药物/疫苗中的应用。