[发明专利]一种热刺激诱导细胞凋亡的方法

说明书

本发明属于细胞生物学技术领域，涉及一种热刺激诱导细胞凋亡的方法，具体为采用PCR控温系统作为热刺激来诱导细胞凋亡的方法。本发明采用梯度逐渐升温的方式；所述的梯度逐渐升温为温度升高后停留一段时间；升到目标温度后，保持一段时间后梯度逐渐降温。本发明建立了基于PCR精确控温系统梯度逐渐升温模式诱导细胞发生凋亡的模型，该方法早期凋亡率大于晚期凋亡率+坏死率，且重现性、稳定性好。早期凋亡率高可以实现对药物的效果验证及相关凋亡蛋白的检测；采用热刺激方法致细胞凋亡可用来模拟机体因多种原因（病原微生物感染、机体炎症反应、一些恶性类的肿瘤疾病等）导致的发热，这种发热导致的热刺激会对机体的心肌细胞等造成损伤。

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，涉及一种热刺激诱导细胞凋亡的方法，具体为采用PCR控温系统或类似的精确控温装置作为热刺激来诱导细胞凋亡的方法。

背景技术

细胞凋亡的概念被提出是用于描述形态学上不同的细胞死亡方式。细胞凋亡被描述为一种独特的细胞死亡途径，细胞主动参与自身清除。对于细胞凋亡的研究，重复和稳定性的方法至关重要。引起细胞凋亡的因素有很多，如化学因素（过氧化氢、二硫苏糖醇、脂多糖、毒物等）、物理因素（缺氧、机械性损伤、高温、低温、电流等）、生物因素（各种致病菌、病毒、寄生虫、氧化低密度脂蛋白、融合蛋白、单克隆抗体）和变态反应等。

热刺激可以诱导许多细胞系的凋亡，但严重的热应激会对生物体及其器官产生负面影响，导致热休克，甚至导致猝死。热刺激诱导的活性氧的产生与各种细胞类型的凋亡有关。热刺激可通过内源性和外源性途径诱导细胞凋亡。大多数据表明，热刺激可通过激活固有的凋亡通路杀死细胞。例如，Bid是一个促凋亡的Bcl-2家族成员，通过Bax/Bak凋亡途径诱导热疗后细胞凋亡，这与它作为Bax和Bak直接激活剂的既定作用一致。对于外源性通路，热刺激对细胞骨架的影响因热刺激的温度和时间的不同而不同。热刺激的信号效应也取决于细胞类型。例如，U937细胞在44°C高温下20分钟可提高Fas的表达水平，同时激活caspase-8和caspase-3。但是，在Jurkat细胞中，42°C、30 min的轻度热刺激并没有引起Fas表达水平的升高，而caspase-8被激活，这表明热应激影响了Fas受体下游的Fas信号传导。

当机体遭遇细菌、病毒侵入时或有炎症发生时，机体发生机能障碍引起机体体温的升高，这种引起机体发热的刺激成为热源性刺激物。采用热刺激方法致细胞损伤可用来模拟机体因多种原因导致的发热使细胞受损这一现象。但是，目前，研究热刺激对细胞凋亡的影响体外实验多采用水浴加热或直接将培养箱温度调至热刺激温度培养的方法，重复和稳定性差。

发明内容

针对热刺激对细胞凋亡的重复和稳定性差，且坏死率高凋亡率低的问题，本研究提供了一种热刺激诱导细胞凋亡的方法，该方法采用梯度逐渐升降温的方法，实现早期凋亡率高的效果，进一步实现对药物的效果验证及相关凋亡蛋白的检测。同时采用热刺激方法致细胞损伤可用来模拟机体因多种原因导致的发热使细胞受损这一现象。

本发明的技术方案如下：

一种热刺激诱导细胞凋亡的方法，采用梯度逐渐升温的方式，所用设备为精确控温装置；所述的梯度逐渐升温为温度升高后停留一段时间，升到目标温度后，保持一段时间后梯度逐渐降温。

所述的设备为： PCR精确控温系统。

上述方法，具体包括以下步骤：

（1）细胞培养；

（2）细胞的处理：取对数生长期的细胞，接种于6孔板中，培养，待细胞长成单层后用胰蛋白酶消化处理，加入新鲜的DMEM培养基调整细胞密度，吸取细胞悬液；

（3）诱导凋亡：热刺激步骤（2）的悬液，加热程序为从37°C开始以0.5-1.5 °C为单位梯度逐渐升温，每个温度梯度保持时间为1-2 min；升至目标温度，保持50-80min，然后梯度逐渐降温；