[发明专利]一种泰乐菌素还原酶突变体及其用途

说明书

本发明提供了一种泰乐菌素还原酶突变体，其是对泰乐菌素还原酶基因第640‑642位碱基进行定点突变，使之形成终止密码子，突变菌株合成泰乐菌素还原酶蛋白时，肽链延伸至第213位氨基酸时终止，形成只包含一个结构域的不完整酶蛋白。本发明突变体在保留该酶部分活性的同时，显著降低其对泰乐菌素的还原活性，从而显著降低了发酵产物中雷洛霉素的含量，提高了泰乐菌素有效成分的积累水平，同时又不影响弗氏链霉菌的正常生长，最终提升了泰乐菌素的产品质量。

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种泰乐菌素还原酶突变体及其用途。

背景技术

泰乐菌素是广泛应用于兽药及饲料添加剂的兽用抗生素，工业生产中主要采用弗氏链霉菌作为生产菌株。泰乐菌素主要由泰乐菌素A(tylosin)、脱碳霉糖泰乐菌素B(desmycosin)、大菌素C(macrocin)和雷洛菌素D(relomycin)4种组分构成，其中泰乐菌素A是最主要的活性组分，因此泰乐菌素A的含量是衡量泰乐菌素发酵产品的标准，实际生产中要求泰乐菌素4种组分含量必须大于95％，其中泰乐菌素A必须达到80％以上。由于发酵生产中泰乐菌素高水平的积累容易导致部分泰乐菌素A转化为雷洛菌素D，因此最终降低了泰乐菌素产品的质量。

泰乐菌素还原酶(Tylosin reductase)是催化泰乐菌素A组分还原为雷洛菌素D组分的酶。泰乐菌素还原酶以NAD为辅酶，属醛酮还原酶超家族，该酶含有一个996个核苷酸的开放阅读框，由331个氨基酸残基构成，包括两个蛋白结构域。虽然敲除泰乐菌素还原酶基因可以终止泰乐菌素A转化为雷洛菌素的还原过程，但同时弗氏链霉菌的正常生长也受到影响，致使这种基因敲除菌株不具有生产价值。

发明内容

针对现有技术不足，本发明旨在提供一种泰乐菌素还原酶突变体及其用途，利用定点突变技术来对泰乐菌素还原酶的基因序列进行改造，从而降低泰乐菌素还原酶的活性，进而降低泰乐菌素还原活性，提高泰乐菌素产品的质量。

本发明目的之一是提供一种能够降低泰乐菌素还原活性的泰乐菌素还原酶突变体。所述泰乐菌素还原酶突变体的氨基酸序列是由如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第214位的色氨酸突变为终止子得到的氨基酸序列。

优选地，所述泰乐菌素还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明目的之二是提供所述泰乐菌素还原酶突变体的编码基因。所述编码基因是由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第640-642位的碱基TGG替换为TGA、TAG或TAA，最终形成相应的终止密码子UGA、UAG或UAA。

优选地，所述泰乐菌素还原酶突变体的编码基因如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示。

本发明目的之三是提供所述泰乐菌素还原酶突变体催化泰乐菌素A还原为雷洛菌素的用途。

本发明目的之四是提供所述泰乐菌素还原酶突变体在降低对泰乐菌素还原活性中的用途。

本发明目的之五是提供包含所述泰乐菌素还原酶突变体的重组载体或宿主细胞。

优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。

优选地，所述宿主细胞为弗氏链霉菌。

本发明目的之六是提供所述重组载体或宿主细胞制备泰乐菌素的用途。

本发明目的之七是提供所述泰乐菌素还原酶突变体的制备方法，对包含所述泰乐菌素还原酶突变体的宿主细胞进行培养，当发酵液OD₆₀₀达到0.6时，添加0.5mM诱导剂IPTG，并从培养物中分离纯化泰乐菌素还原酶突变体。