[发明专利]一种人参游离小孢子诱导培养方法

权利要求书

1.一种人参游离小孢子诱导培养方法，其特征在于：包括下列步骤：

（1）花蕾的选择、预处理和灭菌：在人参初花期，采集单核靠边期的花蕾，并在显微镜下进一步确定小孢子发育时期；将花蕾保湿并置于4℃冰箱中静置1~2d后灭菌；

（2）小孢子分离与纯化：将灭菌后的花蕾用吸水纸沥干水分后放入研钵，加入少量B₅-13提取液，用研磨棒轻轻挤压，使小孢子游离到提取液中，经400目尼龙网过滤至10ml离心管，800r/min离心3min，弃上清，沉淀物再加入少量B₅-13提取液，摇匀，800r/min离心3min，重复两次；弃上清液，所得沉淀物即为纯净小孢子；

（3）热激预处理：将纯化后的小孢子用诱导培养基重新悬浮并调整密度，分装入直径60mm的无菌培养皿内，每皿2.5~3.5ml，Parafilm膜封口；将培养皿置于32℃黑暗条件下培养3d；

（4）诱导培养：将热激后的培养皿转移至25℃黑暗条件下静置培养，当肉眼可见胚状体时，转移至摇床继续培养。

2.根据权利要求1所述的一种人参游离小孢子诱导培养方法，其特征在于：所述步骤（1）中单核靠边期花蕾对应的长度为1.1mm-1.5mm，直径2.1mm-2.8mm，花药颜色为绿色或黄绿色。

3.根据权利要求1所述的一种人参游离小孢子诱导培养方法，其特征在于：所述步骤（1）中灭菌的方法为：将人参花蕾转移入超净工作台无菌烧杯中，倒入70%酒精进行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10min，然后用无菌水冲洗3次。

4.根据权利要求1所述的一种人参游离小孢子诱导培养方法，其特征在于：所述步骤（3）中小孢子密度调整为 1.0×10⁵~2.0×10⁵个/ml。

5.根据权利要求1所述的一种人参游离小孢子诱导培养方法，其特征在于：所述步骤（3）中诱导培养基的配方如下：Ca（NO₃）₂·4H₂O 430-530mg/L，KNO₃ 150-200mg/L，KH₂PO₄100-150mg/L，MgSO₄·7H₂O 52-76mg/L，NaCl 37-45mg/L，FeSO₄·7H₂O 26.4-30.2mg/L，Na₂-EDTA 35.7-39.3mg/L，H₃BO₃ 10.6-14.4mg/L，MnSO₄·4H₂O 20.5-24.0mg/L，ZnSO₄·7H₂O7.7-9.5mg/L，KI 0.5-0.6mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2-0.3mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.05-0.06mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.02-0.03mg/L，胆碱1.2-1.6mg/L，维生素B1 0.4-0.6mg/L，维生素B6 0.4-0.6mg/L，烟酰胺0.4-0.6mg/L，叶酸0.4-0.6mg/L，生物素0.08-0.10mg/L，L-丝氨酸70-110mg/L，甘氨酸1.0-3.0mg/L，丙酮酸钠15-25mg/L，环腺苷酸35-45mg/L，L-谷胱甘肽20-50mg/L，肌醇60-90mg/L，H₂O₂ 80-120μmol/L，三十烷醇0.8-1.0mg/L，2,4-D 1.4-1.6mg/L，KT 0.4-0.6mg/L，褪黑素1.8-2.2mg/L，酵母浸出物400-500mg/L，2-吗啉乙磺酸 60-80mg/L，蔗糖120-140g/L，活性炭80-120mg/L。