[发明专利]一种自来水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法

说明书

本发明属于环境和分子生物学技术领域，尤其涉及一种自来水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法，包括以下步骤：取自来水，静置，使悬浮物基本沉于底部；移取上清液，并用0.22μm微孔滤膜抽滤，得到滤出液；将无水乙醇和浓度为3mol/L的乙酸钠加入到滤出液中，密封混匀得到混合液，置于‑20℃冷藏过夜；将混合液离心，除去上清液，将收集到的沉淀使用Power Soil Isolation试剂盒完成DNA的提取；采用PCR法对提取到的抗生素抗性基因进行检测，得出自来水中游离态抗生素抗性基因的基因拷贝数。相比于现有技术，本发明操作简单，检测速度快，量化结果可信度高。

技术领域

本发明属于环境和分子生物学技术领域，尤其涉及一种自来水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法。

背景技术

自从青霉素在1942年首次被应用于药物治疗以来，抗生素已经广泛用于人类疾病治疗和畜牧养殖业。然而随着社会经济的发展滥用情况愈发严重，造成环境中抗生素残留增加。环境中的抗生素会诱导原生细菌产生耐药性，从而诱导产生抗生素抗性基因(ARGs)，抗生素抗性基因是一种新兴的、持久的环境污染物，在近年来受到学者的广泛关注。ARGs不仅广泛存在于水体、土壤及各个环境介质中，还在城市自来水厂、给水管网甚至在自来水中被检测到，可能通过水平转移等多种转移方式进入食物链和食物网最终进入人体，从而增加了人体的抗生素耐药性，对人类健康造成威胁。

抗生素抗性基因在环境中种类繁多，数量巨大，自来水中ARGs的测定基本上采用0.22μm滤膜过滤的预处理方式收集DNA，即仅仅关注了细胞态ARGs，而自来水中的游离态DNA携带的ARGs研究很少，从而无法完全测定自来水中总体目标抗生素抗性基因。

有鉴于此，确有必要提供一种自来水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有技术的不足，而提供一种自来水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法，操作简单，检测速度快，量化结果可信度高。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种自来水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法，包括以下步骤：

1)取自来水，静置，使悬浮物基本沉于底部；移取上清液，并用0.22μm微孔滤膜抽滤，去除水体中残留的悬浮物和细胞，得到滤出液；

2)将无水乙醇和浓度为3mol/L的乙酸钠加入到滤出液中，密封混匀得到混合液，置于-20℃冷藏过夜；

3)将混合液离心，除去上清液，将收集到的沉淀使用Power Soil Isolation试剂盒完成DNA的提取；

4)采用PCR法对提取到的DNA上的磺胺类sul1和sul2、四环素类tetG和tetC、喹诺酮类qurD和qnrS和大环内酯类ermA和ermB基因进行检测，得出自来水中游离态抗生素抗性基因的基因拷贝数。

作为本发明所述的自来水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法的一种改进，步骤1)至4)均在无菌环境下操作。

作为本发明所述的自来水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法的一种改进，采集城市管网自来水所采用的器皿在使用前需进行以下操作：先经过10％漂白剂浸泡以去除DNA的残留，然后依次使用自来水、Millipore超纯水冲洗干净。

作为本发明所述的自来水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法的一种改进，在步骤3)中，以10000r/min的速度离心10min。