[发明专利]一种自来水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法

权利要求书

1.一种自来水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取自来水，静置，使悬浮物基本沉于底部；移取上清液，并用0.22μm微孔滤膜抽滤，去除水体中残留的悬浮物和细胞，得到滤出液；

2)将无水乙醇和浓度为3mol/L的乙酸钠加入到滤出液中，密封混匀得到混合液，置于-20℃冷藏过夜；

3)将混合液离心，除去上清液，将收集到的沉淀使用Power Soil Isolation试剂盒完成DNA的提取；

4)采用PCR法对提取到的DNA上的磺胺类sul1和sul2、四环素类tetG和tetC、喹诺酮类qurD和qnrS和大环内酯类ermA和ermB基因进行检测，得出自来水中游离态抗生素抗性基因的基因拷贝数。

2.根据权利要求1所述的自来水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于，步骤1)至4)均在无菌环境下操作。

3.根据权利要求1所述的自来水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于，采集城市管网自来水所采用的器皿在使用前需进行以下操作：先经过10％漂白剂浸泡以去除DNA的残留，然后依次使用自来水、Millipore超纯水冲洗干净。

4.根据权利要求1所述的自来水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于，在步骤3)中，以10000r/min的速度离心10min。

5.根据权利要求1所述的自来水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于，在步骤4)中，检测磺胺类sul1基因所采用的引物包括核苷酸序列为CACCGGAAACATCGCTGCA的上游引物sul1-F和核苷酸序列为AAGTTCCGCCGCAAGGCT的下游引物sul1-R，检测磺胺类sul2基因所采用的引物包括核苷酸序列为CTCCGATGGAGGCCGGTAT的上游引物sul2-F和核苷酸序列为GGGAATGCCATCTGCCTTGA的下游引物sul2-R。

6.根据权利要求1所述的自来水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于，在步骤4)中，检测四环素类tetG基因所采用的引物包括核苷酸序列为GCACGCTGGTTTGGCTACA的上游引物tetG-F和核苷酸序列为TGGCTGTGATTAGTCTCCTTGA的下游引物tetG-R，检测四环素类tetC基因所采用的引物包括核苷酸序列为CTTGAGAGCCTTCAACCCAG的上游引物tetC-F和核苷酸序列为ATGGTCGTCATCTACCTGCC的下游引物tetC-R。

7.根据权利要求1所述的自来水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于，在步骤4)中，检测喹诺酮类qurD基因所采用的引物包括核苷酸序列为GGAGCTGATTTTCGAGGG的上游引物qurD-F和核苷酸序列为AGAAAAATTAGCGTAACTAA的下游引物qurD-R，检测喹诺酮类qurS基因所采用的引物包括核苷酸序列为GTGAGTAATCGTATGTACTT的上游引物qurS-F和核苷酸序列为AAACACCTCGACTTAAGTCT的下游引物qurS-R。

8.根据权利要求1所述的自来水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于，在步骤4)中，检测大环内酯类ermA基因所采用的引物包括核苷酸序列为GAAATTGGTTCAGGAAAAGG的上游引物ermA-F和核苷酸序列为AATAGTAAACCTAAAGCTC的下游引物ermA-R，检测大环内酯类ermB基因所采用的引物包括核苷酸序列为GATACCGTTTACGAAATTGG的上游引物ermB-F和核苷酸序列为GAATCGAGACTTGAGTGTGC的下游引物ermB-R。