[发明专利]一种快速准确选育互作型弱感光杂交稻亲本的分子标记方法

权利要求书

1.一种快速准确选育互作型弱感光杂交稻亲本的分子标记方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤一：分析博B和粤丰B中DTH8基因的差异：根据DTH8基因的参考基因组序列，在DTH8基因编码区的两端设计引物分别扩增博B和粤丰B基因组中的DTH8基因，经测序比对后发现，博B中含有一个完整的DTH8基因全长，而在粤丰B基因组中从DTH8基因编码区的第793个碱基开始缺失至 3’端，一共缺失 1110个碱基；

步骤二：推断DTH8基因为控制华南弱感光型杂交稻互作感光的主效基因：根据研究团队之前对华南稻区互作感光基因的初定位结果，以及现有感光基因的文献报道，推断杂交稻亲本保持系/不育系中的互作感光基因为DTH8基因， 该基因编码一个结合CCAAT盒的转录因子蛋白复合体HAP3H的亚基，是主效感光基因；

步骤三：再经转基因功能验证，证明推断的准确性：运用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建DTH8基因编辑载体，以DTH8基因编码区起始密码子附近作为基因编辑靶位点，所述基因编辑靶位点的序列为GTTAGCTTCACATGAAGAGTAGG，通过农杆菌介导的转基因方法，将DTH8基因编辑载体转化至DTH8基因功能正常的亲本博B中；

步骤四：开发用于互作弱感光型杂交稻亲本选育的共显性功能性分子标记：根据博B和粤丰B的DTH8基因的测序比对结果，设计了弱感光型杂交稻亲本选育的功能性分子标记，用于检测该分子标记的上游引物DTH8-F的序列为CAGGAGTGCGTGTCGGAGT，下游引物DTH8-R的序列为TCCGTTGCCTCCTTGCTG，该标记跨过了粤丰B中DTH8基因缺失的1110bp，在博B中扩增目标带为2021bp，在粤丰B中扩增目标带为911bp，双亲之间相差1110bp，因此运用琼脂糖凝胶电泳只需要1.5%的胶浓度，电泳145V运行30min就能够很好的区分双亲及杂种，结果表明运用开发的DTH8基因共显性功能性分子标记能够快速、准确的检测感光单株与非感光单株；

步骤五：利用DTH8基因分子标记进行互作弱感光型杂交稻亲本选育：将互作感光型保持系博B作为DTH8基因的供体，导入感温型优质香型保持系粤丰B中， 获得优质互作感光型保持系。